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1、 第七章 细胞周期与肿瘤 肿瘤共同特征: 细胞周期调控机制的破坏, 细胞失控性生长。 第一节 历史回顾 一、生命复制之迷被一层层揭开 第一次看见细胞； 细胞理论; 细胞生长过程:有丝分裂期、细胞间期； 1951年，细胞周期G1期、S期、G2期、M期。 传统细胞周期分析：细胞的同步化； S期或M期始末时间的观察。 流式细胞术 多参数流式细胞术 DNA/RNA同步分析法 成熟促进因子MPF:正常有丝分裂的启动因子 细胞分裂周期基因cdc MPF: p34cdc2/28，CDKs(细胞周期素依赖性蛋白激酶) 细胞周期素 Cyclins 二.肿瘤发生、发展研究与生命复制研究的会合 癌基因时代 抑癌基因
2、时代 多基因时代、癌基因蛋白网络时代 肿瘤多步骤理论、DNA修复理论、细胞凋亡理论 细胞周期核心理论 三、肿瘤与细胞周期研究的重大突破 肿瘤是多基因变化导致细胞周期紊乱，细 胞失控性生长所致的一类疾病。 肿瘤是多步骤发生、多基因突变的进化性 疾病。 1. “二次打击学说”：视网膜母细胞瘤 具有一种遗传缺陷的子代只是易患肿瘤， 还需要另外的基因缺陷，才发生肿瘤。 肿瘤抑制基因从结构破坏到功能丧失。 2. 肿瘤发生发展是一个细胞克隆进化的过程 结肠癌：APC(肿瘤抑制基因), ras（信号 转导途径), p53（肿瘤抑制基因)，DCC（粘附 因子) 基因阶段性突变 癌基因、抑癌基因的功能效应，都从
3、不同的 途径最终会聚到细胞周期机制上来，直接参与 调控或作为细胞周期调控机制的主要成分。 肿瘤是一类多步骤、多基因突变所致的细 胞周期调控机制破坏、细胞克隆性、进化性疾 病。 第二节 细胞周期机制的核心 CDKs调控机制 间期：G1 、 S、G2期 有丝分裂期：M期 细胞周期调控核心机制： 依赖于细胞周期素特异性、时相性表达、 累积与分解的CDKs 的时相激活。 CDK 催化亚单位：底物结合部位 含ATP结合位点侧链 细胞周期调控核心：蛋白激酶 M期： CDC2 cyclin B1； G2期：CDK2 cyclin A； S期： CDK2 cyclin E; G1期: CDK4,6- cycl
4、in D1, D2, D3 细胞周期过程中，某一CDK含量恒定，活化 与非活化CDK的总量不变。 一、Cyclins是调控CDKs活性的最基本成分 特异性区域： 细胞周期素盒cyclin box：结合并激活CDK ； 特别区间：引导CDKs到特定底物亚细胞部位。 Cyclin蛋白功能： 激活CDKs并加强CDKs对底物的作用。 Cyclin功能的调控： 依赖其蛋白质水平的细胞周期特异性起伏。 细胞周期调控蛋白的降解，控制着细胞周期内 一系列事件的运行顺序、方向和协调。 1. 蛋白质降解： 1983年首次提出； 1989年进一步实验证实； 1991年实验确认。 2.泛肽化介导的蛋白质水解 ： 多
5、个泛肽链接在底物上，被蛋白酶体识别、降解 E1 激活酶： E1泛肽羟基 硫酯结合； E2 结合酶： E3 连接酶：靶蛋白的赖氨酸残基 SCF：G1/S期 APC(anaphase promoting complex)：M期 3. G1-S转换中的蛋白质水解 SCF复合物： Skp1 、Cdc53/cullin 、 F-box(Protain) 有丝分裂的关键调控蛋白Weel也同样受到 SCF系统的调控：当Weel降解后，伴随着DNA 复制的完成，细胞进入有丝分裂期。 SCF系统的两类底物：cdc4 Sicl 4.有丝分裂中蛋白质水解 APC ： 有丝分裂后期促动因子复合物 Cdc16, Cdc
6、23, Cdc27 Cyclin B/Cdk1：1）驱动着细胞进入有丝分裂 期，阻滞细胞完成有丝分裂； 2）灭活机制：APC催化Cyclin B降解; CDK抑制物Sic1与Cyclin BCdk1复合物结合 ; CyclinB降解 Cfi1：细胞间期，核仁，直接与Cdc14结合； 使Cdc14磷酸化失活； Cdc14：1）磷酸酶，使转录因子Swi5去磷酸化 ，产生新的Sci1，后者被Cyclin B/Cdk1磷酸化 而降解； 2) 使Sci1去磷酸化，降低 CyclinB/Cdk1 活性，通过Cdh1去磷酸化，能 与APC结合，使Cyclin B降解，Cyclin B/Cdk1 复合物彻底失
7、活。 APC 激活，使Cyclin B降解， Cyclin B/Cdk1复合物灭活和Sci1累积，使细胞出有丝 分裂后期，完成有丝分裂，进入早G1期。 二、Thr 160/161 磷酸化 Thr160/161磷酸化是CDK激活的重要条件。 CAK(CDK-activating kinase)： CDK激活性蛋白激酶 1)催化亚单位蛋白激酶MO1(CDK7);Cyclin H ； 2)一种CAK能使所有主要的CDK-Cyclin底物 磷酸化而激活； 3) 活性在细胞周期中无起伏状态； 4) 不是限速步骤。 灭活CDK-Cyclin复合物重要机制： 1）Cyclin的去除； 2）Thr160/16
8、1 去磷酸化. 三、Thr14 / Tyr15 磷酸化和去磷酸化 是CDK 激活及失活的重要环节。 磷酸化蛋白激酶Weel , 使 CDC2上的 Thr14 / Tyr15 磷酸化；磷酸酶CDC25 使 CDC2上的 Thr14 / Tyr15 去磷酸化。 CDC2的激活过程： Cyclin B1与CDC2结合； Weel对Thr14/Tyr15进行磷酸化，抑制 CDC2的活性； CAK对Thr160/161进行磷酸化; CDC25 激活，使Thr14/Tyr15 去磷酸化； CDC2被激活。 CDK激活条件： 1. 与特定Cyclin结合； 2. Thr14/Tyr15磷酸化及去磷酸化； 3
9、. CAK 使Thr160/161磷酸化； 4. Cyclin-CDK活性高于CKI。 CDK失活条件： 1. Cyclin 降低； 2. Thr14/Tyr15磷酸化； 3. Thr160/161去磷酸化； 4. TGF-1存在（Cyclin D, E-CDK2, A ）； 5. CKI结合并失活Cyclin-CDK。 四、细胞周期依赖性蛋白激酶抑制物 调控CDKs活性机制： Cyclins、CAK、 Weel/Cdc25 的磷酸化和 去磷酸化、CKIs（细胞周期依赖性蛋白激酶抑 制物） CKI家族两大类： 1) Cip/Kip 家族：p21 p27 p57 N端:与CDK结合的相同结构域；
10、 与CDK结合后，抑制G1、S期Cyclin-CDK , 是控制G1/S转换的CDK的抑制剂 ； C端:结构与功能各不相同。 特点：p21 C端有PCNA结合结构域， p21 有两个p27结合位点 2) INK4家族：p15 p16 p18 p19 主要与CDK4、CDK6的抑制密切有关。 特点： p16不随细胞周期时相变化； p19 随细胞周期规律性震荡。 TGF-1能促进 p15 mRNA 表达，抑制细胞 增殖。 CKIs所识别的是多数CDK-Cyclin复合物， 不是CDK单体；p16 INK4a同CDK4 单体结合。 当 DNA损伤及细胞衰老，具有转录因子作用 的 p53增高，诱导 p
11、21Cip1的转录增强，后者 与相应的 CDK-Cyclin 复合物结合，抑制蛋白 激酶的激活，阻滞细胞周期的进行。 第三节 细胞周期调控的两大机制 一系列Cyclins 时相性起伏，相应CDKs依 次激活，驱动细胞通过G1、S、G2期，到达M期。 一、细胞周期的启动机制 主要调控点：G1期 酵母：“起始点” START，细胞内外信号 人类细胞： “限制点” restriction point ， 早期应答基因（c-Fos,c-Jun), 延迟应答基因 (Cyclin D) 信号转导 细胞周期的联结途径： Cyclin D - Cdk4/6 Cyclin E - Cdk2 G1期限速步骤 生长
12、信号（信号途径、早期应答基因） Cyclin D,Cyclin D-Cdk4/6 Cyclin D-Cdk4/6 - p27Kip1复合物 Cdk4/6摄取、转移磷酸基团 1）pRB低磷酸化状态：pRB与E2F结合，抑制S 期必须基因产物表达，阻止G1/S、DNA合成， 阻断细胞周期； 2）pRB高磷酸化状态：pRB失活，释放转录 因子（如E2F），产生多种蛋白质，驱动细胞 周期的进行；Cyclin E升高，Cyclin E-Cdk2 复合物，促使p27Kip1减少，Cdk2活化； Cyclin E-Cdk2使p27Kip1磷酸化，成为泛肽 化蛋白水解的靶 ，降解。 正是Rb pathway
13、的E2F正反馈机制协同 p27Kip1降解机制，使细胞在“restriction point”后，越来越少地依赖生长因子或有丝分 裂因子。 二、 细胞周期的监控机制 检测点 checkpoint 功能分类: DNA损伤检测点 时相次序检测点 监控机制: 探测部分（特定基因产物） 制动部分（细胞内信号转导） 检修部分 处理部分 1. DNA损伤检测点 p53 pathway ; Cdc25 pathway DNA损伤，信号传递给p53; p53 稳定性增高，p53蛋白水平升高; 启动p21的转录，p21蛋白迅速升高，与多 种CDK-Cyclin复合物直接结合, 抑制CDKs的 激活，阻滞G1/S
14、的过渡，为修复DNA提供足够 的时间。 ARF-Mdm2-p53 pathway INK4a基因编码 p16INK4a、ARF/p14ARF）。 Rb pathway激活后，E2F1、Myc等将导致ARF蛋 白的积累：1）破坏Mdm2的功能（阻断p53转录 、使p53泛肽化、强制性使p53转运到胞浆中） ，结果是p53出现积累，导致细胞周期运行滞 留，乃至发生细胞凋亡； 2）细胞对DNA损伤更为敏感。 G2期检测点： 当DNA损伤，激活hATM/hATR，使Chk1蛋白 激酶磷酸化，作用于磷酸酶Cdc25(Ser-216磷 酸化)，磷酸化后Cdc25与14-3-3蛋白结合、扣 留、失活，不能将
15、CDC2蛋白激酶Thr-14/Tyr- 15位去磷酸化，使CDC2不能激活，导致G2期阻 滞。 2.时相次序检测点 有丝分裂与DNA复制严格的时相次序。 1）有丝分裂促进因子MPF：G2、S期， 诱发 有丝分裂；染色体凝集。 2）S期促进因子SPF： 诱发G1期细胞核进入S期； S期CDKs存在于S期的开始到M期的结束 ； 只启动一次DNA复制。 3）S期启动 (1) S期开始前组装pre-RC（复制前复合物） ORC Cdc6p Mcm (2) S期CDKs和DDK（Cdc7-Dbf4）共同启动 DNA的复制。 4） S期CDKs的双重功能：引发DNA复制的启 动；防止pre- RC重复组装
16、。 M期CDKs：防止pre-RC重复组装。 5）有丝分裂后期促进复合物（anaphase- promoting complex, APC, cyclosome)： 调控姐妹染色体的分离和M期Cyclin的降解 。 M期CDKs的激活并积累使APC处于活化 状态，一直持续到G1期；G1期CDKs的激活 并积累又抑制了M期Cyclin和APC底物的成熟 前累积。 第四节 细胞周期的界面机制 细胞周期与信号转导、基因转录、DNA修复 、细胞凋亡、细胞分化等多种生命活动密切相 关。 一、细胞周期与DNA修复 发现DNA损伤/错误的传感器，受损细胞的 扣留，修复DNA，决定继续分裂或死亡。 传感器：人类ATM，p53基因 ATM 编码蛋白激酶，结合在损伤的DNA 上，能将某些蛋白磷酸化，中断细胞周期。 信号通路：1）激活Chk1，引起Ser216磷酸 化，抑制CDC25，抑制M
