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1、 乙肝六项的操作、注意事项 及检验结果的解释 乙肝六项操作 HBSAg (双抗体夹心法） 原理 在微孔条上预包被，被纯化的乙肝表面抗 体，配以酶标记抗体（HBsAb-HRP）及 TMB等其它试剂，采用夹心法原理检测人 血清（或血浆）中乙肝表面抗原（HBsAg ）。 乙肝六项操作 HBSAg (双抗体夹心法） 操作步骤 一.准备 1.1平衡：将试剂盒各组分别取出，平衡 至室温（18-25）， 1.2配液：浓缩洗涤液配制前充分摇匀（如有 晶体应充分溶解）， 浓缩洗涤液和蒸馏水或去离子水按25倍稀释 后使用。 1.3编号：将微孔条固定于支架，按序编号。 乙肝六项操作 HBSAg (双抗体夹心法) 二
2、.HBSAg操作 2.1加样：分别用加样器在对照孔中加入阴、阳性对照血清各75l于相 应孔中。 2.2温育：置37温育60分钟。 2.3 加酶：不用洗涤，分别在每孔中加入酶标记抗体50l，轻轻混匀。 2.4 温育：置37温育30分钟，室温平衡5分钟。 2.5 洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完扣干（每次应保持30-60秒的 浸泡时间）。 2.6显色：每孔加入底物A、B各50l，轻拍混匀，置37暗处30分钟。 2.7终止：每孔加终止液50l，混匀。 三.HBSAg测定 用酶标仪单波长450nm或双波长450/630nm测定各孔OD值（用单 波长测定时需设空白对照一孔，30分钟内完成测定，并记录结
3、果） 。 乙肝六项操作 HBSAg (双抗体夹心法) 结果判断与分析 临界值（C.O.）的计算：Cutoff临界值=阴性对 照孔OD值N2.1，阴性对照OD均值大于0.05时 按实际OD值计算，小于0.05时以0.05计算。 结果判定：样品OD值S/C.O=1者为HBsAg阳 性 样品OD值S/C.O=1者为 阳性 样品OD值S/C.O1者为阴性 9. 质量控制：每次均应有阴阳对照，其 OD值应在要求范围内。 乙肝六项操作 HBCAb-lgM(捕获法） 10.参考值范围： 参考值cut-off value(COV)=阴性对照平均OD值x 4 阴性对照OD值低于0.050作0.050计算，高于0
4、.050按实 际OD值计算。 示例1： 阴性对照孔1 COV: 0.016. 阴性对照孔2 COV: 0.010. 0.05040.200 示例2： 阴性对照孔 COV: 0.056 阴性对照孔 COV: 0.060 （0.056+0.060）/240.232 ELISA法检测乙肝六项的 注意事项 及结果分析 酶联免疫吸附试验(简称 ELISA 法)检测乙型肝炎 免疫学标志物问世以来， 由于测定灵敏高 、特异好 和操作简便等诸多优点， 具有实用性和可操作性 ， 并广泛应用于各类医院实验室 ，作为检测乙肝血清 标志物的首选 ，但通过对临床乙肝六项检测的观察 、 存在不同血清物质变化及各种影响因素
5、 ，直接或 间接的影响检验结果的正确表达 。综合资料和实践 ，作如下探讨： 1 样本的采集与处理影响 1.1 样本离心处理不全， 使得标本严重溶血及混有 红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗 净 ，残留在孔内的血红蛋白，具有过氧化物酶样 的活性， 催化底物显色造成假阳性， 溶血标本禁 用。 1.2 正常血液采集后半个小时至两小时开始凝固， 有时 工作中为了快速检测 ，常会在血液未开始凝固时 ，即 强行离心分离血清 。 特别是在冬天 使得血清中残留部分纤维蛋白原，在 ELISA 测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白凝块附 着在酶标反应孔壁内使得不易洗掉 易造成假阳(阴)性、 影响结果 。
6、因此血液标本采集后要使其充分凝固后再分离血清，标 本离心时 ，可加大离心转速 ，延长离心时间 或者要节 约时间就用带分离胶的采血管采集标本。 1.3 血清标本应避免细菌污染， 细菌的一些内源性 酶本身会对相应酶作标记测定方法产生干扰。 1.4 标本储存时间不宜过长， 应新鲜 4 保存不宜 超过7天 ，以免因标本中的 IgG 聚合导致本底加深 甚至假阳性，影响判断结果。 2 试剂的影响 2.1 试剂盒在运输中时间太长 ，温度过高会使显色偏 淡，灵敏度偏低 ，要求试剂盒应存放于 2 -8 冰箱 中，从冷藏环境中取出的试剂盒、全部瓶装试剂以及 待测标本所需的微孔反应板，都应预先在室温下平衡 后，再开
7、启使用 。余者应及时封存于冰箱。 不同批号试剂盒中的组份、不能进行交叉使用 ，包 括试剂瓶盖，相互交叉使用 ，有可能出现显色浅或 本底高 ，花板情况。 所以不同试剂瓶盖不能混淆， 试剂盒不要使用超过有效期。 2.2 不同厂家出产的试剂特异性和敏感性不相同 。 有的厂家酶标板空间 A 值差 15% ，标记酶 活性及显色液的稳定性较差，使用劣质试剂必 然导致结果的假阳性或假阴性 。 选择高质量的试剂是保证检验结果准确的关键 之一 3 操作技术的影响 3.1 加样吸嘴的洁净和吸液量的准确性直接影响结果 ， 移液器吸量不足 ，移液抽吸排放太快， 吸头内壁挂液 太多或内壁不清洁， 所以要定期校正移液器，
8、 吸头要 配套， 每次装吸头要吻合紧密， 移液不宜过快， 排放 应完全 ，尽可能使用同一移液器和装紧吸头移液时用 力及抽吸速度均匀一致 加样后要充分混匀 ，在 100 ul 和 50 ul的移液不精密度应 在1%范围以内， 分别在99 -101 ul和 49.5- 50.5 ul之间。 3.2 温浴影响 96 孔酶标板结构特别 ，易产生边缘效 应 ，抗原抗体结合及酶促反应对温度要求严格， 标 本要贴好密封膜 ，防止水蒸气和污物浸入， 放置 37 水浴箱时 ，应让反应孔底部 2/3 浸入水中， 才能 减少受热不均 避免边缘效应 ，干浴与水浴存在明显 的差异 ，尽可能使用水浴 ，并控制好水浴时间。
9、 3.3 洗涤是 ELISA 法操作的重要环节， 洗涤液的配制要严 格按照说明书进行操作 ，不能用自来水代替蒸馏水配制 因为自来水中的次氯酸钠会影响结果 ，手洗易交叉污染 尽量使用洗板机洗涤， 血清中残留的纤维蛋白或洗涤瓶 ，未经常清洗而留有的污垢 ，结晶易使洗板机针孔全堵 塞或半堵塞 ，造成未结合标记酶洗脱不彻底， 导致花板 而造成假阳性或假阴性 ，所以操作洗板机过程中要不时 观察洗板机针孔内洗液的通畅情况 ，及时纠正调整， 洗 板机要做好维护保养， 不用时应用去离子水清洗几遍。 3.4 显色剂应避光保存 滴加显色剂 A 、B 时 ，顺序不 能颠倒 ，注意不要漏加， 显色时间要严格控制， 可
10、 用计时器来计时，保证准确， 肉眼判断结果时， 显 色浅不易观察， 影响结果准确性， 必须使用酶标仪 检测结果， 以保证结果一致性 ，滴加终止液后随着 时间的增加， 吸光度值逐渐下降， 而且浓度越高其 吸光度随时间下降越快， 可能会产生假阳性或假阴性 结果，建议在终止反应后立即比色。 4 钩状效应(Hook)影响 随着 ELISA 一步法的应用 ，在日常工作中会发现 HBsAg阴性而 HBeAg 阳性的现象 ，其原因就是当 标本中的抗原浓度过高时产生的钩状效应 (Hook)现 象 ，从而出现假阴性造成真阳性的漏检， 即随着被 测物浓度增高反而显色减弱甚至不显色， 往往造成 假阴性结果 ，采用同
11、步稀释测定或用线性范围高的 乙肝六项定量法可以减少 Hook 效应的发生。 有学者认为大约 40%的人血清标本中含有非特异性 干扰物质 ，可以不同程度影响检测结果 ，常见的 干扰物质有： 类风湿因子、 补体、异嗜性抗体 、 治疗性抗体 、溶菌酶、总蛋白浓度等， 某些自身 抗体都会影响结果造成假阳性。 5.干扰物质的影响 6 药物的影响 高效价的乙肝免疫球蛋白会与表面抗原形成复合物,影 响 HBsAg 的检出,所以一些 HBsAg 阳性患者注射乙肝免疫 球蛋白后,HBsAg 检测会呈阴性反应,导致乙肝两对半少见 模式的出现。为预防乙肝，部分 HBsAg 阴性人群在接种乙肝 疫苗后的 1 2 周内
12、，血清中可检出 HBsAg 成分，形成一过性 HBsAg 阳性，这可能是乙肝疫苗主要成分是 HBsAg，建议接 种乙肝疫苗后 1 个月内不应作 HBsAg 检测。 总之,没有严格的室内质控,没有规范的操作规程,结果 判定用肉眼而不用仪器,操作随意(如试剂自冰箱取出后不复温, 温育时不封板,洗板后无扣板过程),试剂、仪器、器材(如 微量移液器)质量差等。而对一些操作细节(如温育时间的控 制)的忽视都可能导致结果的不同。乙肝六项检测必须排除 各种影响因素的干扰，才能为临床提供正确可靠的检测依 据。 乙肝表面抗原前S1 HBSAg前S1： 1.主要存在于完整乙肝病毒表面 , 2.肝细胞膜上存在有前S
13、1蛋白受体 , 3.诱导 乙肝病毒吸附在肝细胞表面 , 4.促使病毒进入肝细胞内. 乙肝核心抗体临床意义 乙型肝炎核心抗体是人体感染乙型肝炎病毒后第一个出现的抗体,是 人体感染乙型肝炎病毒血清学标志物之一. 乙型肝炎核心抗体又可分为乙型肝炎核心抗体IgM（抗HBc.IgM）和乙型肝 炎核心抗体IgG(抗HBc.IgG)两种,前者随ALT升高而不断增长.大约在乙型肝 炎病毒感染后1-2个月时,随者ALT升高而不断增长. 大约在乙型肝炎病毒感染后1-2个月时,随之产生的便是乙型肝炎核心抗体 IgG. 目前认为,抗HBc.IgM是乙型肝炎病毒新近感染或持续复制的标志,这种抗体 持续阳性提示疾病迁延,
14、 而抗HBc.IgG的持续存在只能说明以往有过乙型肝炎病毒感染. 因此,乙型肝炎核心抗体IgM和IgG平行检测,有助于对急性乙型肝炎与隐匿 型乙型肝炎和乙型肝炎病毒携带者急性发作之间的鉴别. 约有20%急性乙型肝炎病人的血清中查不到乙型肝炎表面抗原,而乙型肝炎 核心抗体IgM可阳性,而且与病情变化相一致,病情恢复,乙型肝炎核心抗体 IgM阴转.当病情重新活动时,ALT重新出现异常时,乙型肝炎核心抗体IgM亦 重新出现阳性,滴度上升.所以说, 乙型肝炎核心抗体IgM是用来评价乙型肝炎病情的较好指标 常见乙肝六项检验结果 的解释 HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAbHBcAb- lg
15、M简简要意义义 乙型肝炎表 面抗 原 乙型肝炎表 面抗 体 乙型肝炎e抗 原 乙型肝炎e抗 体 乙型肝炎核 心抗 体 乙型肝炎核心 抗体 lgM HBsAg是乙肝病毒标标志物，阳性提示乙肝携带带；HBeAg、 HBcAb- lgM 阳性提示乙肝病毒复制活跃跃,传传染性强,是治 疗疗疗疗 效评评价的重要指标标；HBsAb、HBeAb阳性提示机体 产产生免疫力抵抗病毒，趋趋于恢复。 -没有乙肝病毒感染，不具备备免疫力 -+-接种疫苗，乙肝恢复，具备备免疫力 +-表面抗原携带带；急性乙肝病毒感染潜伏期后期 +-+-+急性乙肝早期，病毒复制，有传传染性强 +-+-+急慢性乙肝，病毒复制，有传传染性强
16、+-+-急慢性乙肝，没有传传染性或传传染性弱 +-+-急慢性乙肝，没有传传染性或传传染性弱 +-+急慢性乙肝，病毒复制有传传染性，乙型肝炎E抗原变变异 -+-乙肝核心抗隐隐性携带带，有乙肝既往有感染史 -+-急性乙肝恢复期或既往有感染史 -+-+-乙肝恢复期或既往有轻轻度乙肝病毒感染史 +-+-慢乙肝病毒感染携带带，没有传传染性或传传染性弱 +-+急性乙肝趋趋于恢复，表面抗原携带带，病毒复制，有传传染性强 -+提示乙肝病毒早期感染，有传传染性 乙肝五项常见模式 1 - - - - - 过去和现在未感染过HBV。 2 - - - - + (1)既往感染未能测出抗-HBs； (2)恢复期HBsAg已消，
