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1、 I 分类号： S432 单位代码：10335 密 级： 无 学 号：10716067 博 士 学 位 论 文 博 士 学 位 论 文 中文论文题目中文论文题目: 桑细菌性枯萎病病原的定名、 分子检测及肠桑细菌性枯萎病病原的定名、 分子检测及肠 杆菌基因水平转移的研究杆菌基因水平转移的研究 作者姓名： 朱 勃 指导教师： 谢关林 教授 专业名称： 植物病理学 所在学院： 农业与生物技术学院 论文提交日期论文提交日期 二零一零年六月二零一零年六月 中国杭州中国杭州 II 博博 士士 学学 位位 论论 文文 论文题目论文题目 桑细菌性枯萎病病原的定名、分子检测及肠桑细菌性枯萎病病原的定名、分子检测
2、及肠 杆菌基因水平转移的研究杆菌基因水平转移的研究 作者姓名作者姓名 朱勃朱勃 指导教师指导教师 谢关林谢关林 学科学科(专业专业) 植物病理学植物病理学 所在学院所在学院 农业与生物技术学院农业与生物技术学院 提交日期提交日期 2010-6 III Nominating, Molecular Detection about Bacterial Wilt in Mulberry and Horizontal Gene Transfer Analysis in Enterobacteriaceae By Zhu Bo A Dissertation Submitted as Partial Ful
3、fillment of the Requirements for the Degree of Doctor of Philosophy in Plant Pathology in ZHEJIANG UNIVERSITY Supervisor: Prof. Xie Guan-Lin Hangzhou, 310029 Zhejiang, Peoples Republic of China July, 2009 IV 致 谢 本论文是在谢关林教授的悉心关怀和指导下完成的。从论文的选题、研究方 案制定、 实验实施到论文撰写无不倾注了导师巨大的心血。恩师广博的学识， 严谨的治学态度， 对科学真理孜孜不倦
4、的追求和为科学事业无私奉献的精神使 我终生受益。导师不仅教我做事还教我做人，导师严于律己宽以待人的为人处世 态度是我学习的楷模。在此，我谨向恩师致以最诚挚的谢意和衷心的祝福！ 浙江大学 985 平台实验室徐幼平老师在脂肪酸分析试验中使我受益良多，感 谢比利时天主教鲁汶大学 Ren De Mot 教授对于文章的修改帮助，浙江大学的沈 卓群、李芳同学亦为本试验付出了辛勤的劳动。感谢浙江省农业厅经济作物局高 级农艺师周勤，杭州市植保土肥总站推广研究员徐福寿在材料准备中给予的方 便。 在平时的工作和生活中， 我得到了本实验室李斌师兄、 王国芬师姐以及方媛、 余山红、邱文、苏婷、王芳、唐乔梅、张国庆、刘
5、宝平、储福强、田文效等同仁 的热情帮助，感谢她们在三年的学习中给予我的关心。其中尤其要感谢我的夫人 楼妙苗在实验及生活上的大力帮助。 此外还要感谢浙江大学生物信息研究所的金 谷雷博士在程序设计及编译上的大力帮助。 最后我要特别感谢一直关心支持我的父亲、母亲，他们的支持是我进步的源 动力。 最后向参加论文评阅、评议和答辩委员会的教授、专家们致以诚挚的谢意！ 朱 勃 2010 年 06 月于浙大华家池 V 本学位论文受本学位论文受 国家自然科学基金项目（30871655，30671397） 、863 项目 （2006AA10A211）和浙江省三农五方项目“突发性桑细菌性 枯萎病防控技术的研究与推广
6、” （SN200811） 资助资助 I 目 录 摘 要.V ABSTRACT.VII 1 文献综述.1 1.1 已报道的一些桑树细菌病害1 1.1.1 国内已报道的桑树细菌病害1 1.1.1.1 桑青枯病（Mulberry Bacterial Wilt）.1 1.1.1.2 桑疫病（Mulberry Bacterial Blight） .2 1.1.1.3 桑树植原体病害（Mulberry Mycoplasmas Disease）.2 1.1.2 国外已报道的几种桑细菌病害3 1.2 肠杆菌属的分类3 1.2.1 与动物相关的肠杆菌4 1.2.1.1 产气肠杆菌（Enterobacter ae
7、rogenes）.4 1.2.1.2 河生肠杆菌（Enterobacter amnigenus）4 1.2.1.3 阴沟肠杆菌阴沟亚种（Enterobacter cloacae subsp. cloacae）4 1.2.1.4 日沟维肠杆菌 (Enterobacter gergoviae).4 1.2.1.5 霍米奇肠杆菌（Enterobacter hormaechei）5 1.2.1.6 神户肠杆菌（Enterobacter kobei） 5 1.2.1.7 坂崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）5 1.2.1.8 泰洛肠杆菌（Enterobacter taylorae）
8、5 1.2.2 与植物相关的肠杆菌6 1.2.2.1 成团肠杆菌（Enterobacter agglomerans）6 1.2.2.2 阿式肠杆菌（Enterobacter asburiae）.6 1.2.2.3 生癌肠杆菌（Enterobacter cancerogenus）.6 1.2.2.4 阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）.6 1.2.2.5 阴沟肠杆菌溶解亚种（Enterobacter cloacae subsp. dissolvens）7 1.2.2.6 溶解肠杆菌（Enterobacter dissolvens）.7 1.2.2.7 中间肠杆菌（Entero
9、bacter intermedius）7 1.2.2.8 Enterobacter ludwigii7 1.2.2.9 超压肠杆菌（Enterobacter nimipressuralis）8 1.2.2.10 水稻肠杆菌（Enterobacter oryzae） 8 1.2.2.11 梨形肠杆菌（Enterobacter pyrinus）.8 1.2.2.12 Enterobacter radicincitans8 1.2.3 与环境相关的肠杆菌8 1.2.3.1 Enterobacter cowanii 8 1.2.3.2 瑞典肠杆菌（Enterobacter helveticus）.8
10、1.2.3.3 粉尘肠杆菌（Enterobacter pulveris）9 1.2.3.4 苏黎世肠杆菌（Enterobacter turicensis） .9 1.3 确定肠杆菌常用的一些手段9 1.3.1 形态和生长条件的测定9 1.3.2 生理生化等指标的测定9 II 1.3.3 系统发育树分类特征测定10 1.3.4 DNA-DNA 同源性测定10 1.3.5 致病性12 1.4 植物病原细菌及其肠杆菌的主要检测方法研究13 1.4.1 产地检疫检测13 1.4.2 分离检测13 1.4.3 选择性培养基检测13 1.4.4 致病性的测定13 1.4.5 PCR 技术在植物病原细菌的分
11、子生物学检测的应用.14 1.4.5.1 特异性基因用来检测和鉴定病原菌.14 1.4.5.2 保守基因用来检测和鉴定病原菌.15 1.4.5.3 质粒基因在检测中的应用.15 1.4.6 分子检测在肠杆菌中的应用16 1.5 细菌水平转移（HORIZONTAL GENE TRANSFER, HGT）的研究.16 1.5.1 水平转移的机制17 1.5.1.1 自然转化.17 1.5.1.2 转导.19 1.5.1.3 接合.20 1.5.2 可动遗传因子（MGEs）在农业环境中的细菌种群的分布.20 1.5.2.1 MGEs 在土壤及植物相关细菌中的流行20 1.5.2.2 影响土壤中水平转
12、移的因素.21 1.5.3 MGEs 增加了土壤及植物互生细菌的多样性21 1.5.4 水平转移检测的一些手段及方法22 1.5.4.1 序列组成分析法.22 1.5.4.2 基因有无矩阵法.23 1.5.4.3 系统发育树构建法.23 1.6 本研究的背景及研究内容与目的24 1.6.1 研究的背景24 1.6.2 研究的内容与目的.25 2 桑树细菌性枯萎病病原的鉴定与命名.26 2.1 材料与方法27 2.1.1 标准菌株27 2.1.2 病原细菌的分离27 2.1.3 病原的常规细菌学及过敏性反应与致病性测定27 2.1.4 病原细菌的电镜观察28 2.1.5 病原的 Biolog 鉴
13、定.28 2.1.6 病原的脂肪酸（FAME）鉴定.28 2.1.7 ERIC-PCR 鉴定.28 2.1.8 病原的 16S rRNA 及 rpoB 序列的鉴定及系统发育分析.29 2.1.9 DNA-DNA 同源性分析29 2.2 结果与分析30 2.2.1 病原细菌的细胞形态与菌落培养性状30 2.2.2 病原细菌的过敏性反应及致病性31 III 2.2.3 病原细菌 Biolog 鉴定结果.32 2.2.4 病原细菌的 FAMEs 鉴定结果.33 2.2.5 病原细菌的 ERIC-PCR 分析34 2.2.6 生理生化反应及碳源利用34 2.2.7 病原菌的 16S rRNA 序列及
14、rpoB 序列的比较分析及系统发育分析.38 2.2.8 DNA-DNA 同源性的测定38 2.2.9 对 Enterobacter morus 的描述.42 2.3 讨论43 2.5 本章小结44 3 桑树细菌性枯萎病病菌的检测.46 3.1 材料与方法46 3.1.1 菌株的来源46 3.1.2 桑枯萎病样本采集47 3.1.3 DNA 的提取及纯化47 3.1.4 桑树采集样本直接 PCR 的模板制备47 3.1.5 菌悬液的制备47 3.1.6 测序及引物的设计47 3.1.7 PCR 及 RT-PCR 检测桑枯萎病菌 E.morus 的参数设定51 3.1.8 桑枯萎菌 PCR 检测
15、的灵敏性测定51 3.2 结果52 3.2.1 PCR 反应的特异性.52 3.2.2 PCR 反应的灵敏度.52 3.2.3 PCR 反应结果的验证.52 3.3 讨论56 3.4 本章小结57 4 肠杆菌科细菌水平转移的研究.58 4.1 材料与方法59 4.1.1 序列的获得59 4.1.2 同源基因的获得60 4.1.3 物种树的构建60 4.1.4 基因获得与丢失的最大似然法检验61 4.1.5 水平转移所获得基因的来源分析62 4.1.6 水平转移所获得基因的功能分类62 4.1.7 正向选择的分析62 4.2 结果与讨论63 4.2.1 系统发育树的构建63 4.2.2 基因分布
16、类型情况64 4.2.3 水平转移获得基因的功能分类66 4.2.4 核心基因（core genome ）和泛基因（pan genome）的计算70 4.2.5 基因获得与丢失在肠杆菌科细菌进化历史中的重建73 4.2.6 正向选择的结果76 4.2.7 水平转移所获得的基因的来源分析77 4.3 本章小结84 IV 5.结论与展望.85 5.1 结论85 5.2 展望86 参考文献87 附录-1 梨火疫病病原菌 （Erwinia amylovora） III 型分泌系统的鉴定及 Erwinia spp. HrpA 的分析95 附录-2 培养基和试剂配方104 附录-3 图片与表格.105 浙江大学博士学位论文 摘要 V 摘摘 要要 2006 年初夏在浙江杭州地区的桑树主栽区发生一种严重的桑树新病害桑 细菌性枯萎病，病害逐年加重，对蚕桑生产造成了严重损失。为有效治理该病，
