《棉铃虫hsp90、胸腺素和丝氨酸蛋白酶抑制因子在发育中的表达模式与激素调控(1)》由会员分享，可在线阅读，更多相关《棉铃虫hsp90、胸腺素和丝氨酸蛋白酶抑制因子在发育中的表达模式与激素调控(1)（76页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、分类号：Q 7 8 密级： 单位代码：1 0 4 2 2 学号：2 0 0 7 114 7 4 第办孚 硕士学位论文 S hand o n gU n i v e r s i t yM aster SThesis 论文题目：棉铃虫H s p 9 0 、胸腺素和丝氨酸蛋白酶 抑制因子在发育中的表达模式与激素调控 H o r m o n er e g u l a t i o na n de x p r e s s i o np a t t e r no fH s p 9 0 ，t h y m o s i n a n dp i na n dd u r i n 2d e v e l o p m e n
2、to fHelicoverran s e r pd e v e l o p m e n tO tH e l i c o v e r p aa r m l 。g e r an n 2 作者 专业 导 师 合作导 师 张凤霞 生物化学与分子生物学 赵小凡教授 2 0 10 年5 月2 0 日 原创性声明 m Y 舢1 1 1 l 7 吣9 吣m 1m 2 啪0 m 9 脯 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方
3、式标明。本人完 全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：銎凰宣 日期：加p 护 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：张匾鏖导师签名：aI暑oI翳e舀口占暑。笛 自：大学硕卜学倚论文 图6 2 0 E 对H a T H Y I 和H a T H Y 2 的表达调控。上图为2
4、琼脂糖电泳结果，l B - a c t i n 作为内 参。下图为三次独立实验统计得到的对应的直方图。星号表示显著差异，p 皇 耋O 掌，葶，穸 m i d g u t 葺 毫 2 曩 葺 厶 乞1 5 曩 Z 昌 宝l o L 厶 墨0 5 o Z 曩 趸0 司 士 壬 厂 一广 一门n 广 葶葶葶掌萨穸毒。 葶掌F 掌爹掌 S 2 5 l 5 O y 厶 L 仉 曲 厶 L 仉 的 二号l山誊墨uoI蓉&虿暑曩Ia譬 瞰 l I J 尔大学硕十学付论文 h 。e m 讥e 。露燮鬻翟繁黪繁零鬻鬻絮黧笺翟曩? 翔 胁一姗邕蠢誊誊羹溢誊叠盏羞羞蕾翻 o 6 0 4 Oh 由血口且 葶芦葶掌穸。
5、 图4 H a S e r p l n 在四种组织发育阶段的表达模式。从上到下分别为表皮、中肠、脂肪体和血 细胞中H a S e r p i n 转录水平检测的R T - P C R 统计分析结果。 F i g 4 R T - P C Ra n a l y s i so fd e v e l o p m e n t a le x p r e s s i o np a t t e r n so fH a S e r p i ni nv a r i o u st i s s u e s I n t e g u m e n t , m i d g u t , f a tb o d y a n dh
6、a e m o c y t e s i n c l u d e d p - a c t mw a su s e da sa c o n t r 0 1 H a S e r p i n j - a c t i n 2 5 2 1 5 l O 5 O 一广 一，mm I 壬 一广 ；梦鸯鸯专零岑萝梦梦矿矿 图5 2 0 E 对H a - s e r p i n 的表达调控。上图为2 琼脂糖电泳结果，I B - a c t i n 作为内参。下图 为三次独立实验统计得到的对应的直方图。星号表示显著差异，p O 0 5 。 从左道右，泳 道分别为对照( 不处理) ，D M S O 刺激l h ，D M
7、 S O 刺激3 h ，D M S O 刺激6 h ，D M S O 刺激 1 2 h ，D M S O 刺激2 4 h ，2 0 E 刺激l h ，2 0 E 刺激3 h ，2 0 E 刺激6 h ，2 0 E 刺激1 2 h ，2 0 E 刺激 2 4 h 。 F 迫5A n a l y s i so ft h ee f f e c t so f2 0 Eo nt h ee x p r e s s i o nl e v e l so fH a - s e r p i n T h eb o t t o mp a n e l s h o w s - a c t i na sc o n t r
8、0 1 口i n d i c a t e ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s P 0 0 5 C o n t r o l ：n o r m a ll a r v a l D1 ，D 3 ，D 6 ，D12a n dD2 4r e p r e s e n tt h ed u r a t i o n s ( h o u r s ) o fl a r v a li n j e c t e dw i t hD M S O 2 0 El ， 2 0 E 3 ，2 0 E 6 ，2 0 E 1 2a n d2 0 E2 4r e p r e s e n
9、tt h ed u r a t i o n s ( h o u r s ) o fl a r v a li n j e c t e d 、v i t h2 0 E 罱口。嚣、二一盘-的矗墨葺e荡“Q1盘KQ oI壹薯一。重 -冀置j琶再昂矗工_g饧蟹旨窜眉i卫笛 I f l 东大学硕 学付论文 4 H a S e r p i n 的激素调控 提取注射2 0 E 后不同时间段的中肠的R N A ，反转录c D N A 后进行R T - P C R 分析2 0 E 对H a S e r p i n 表达的影响。结果发现，虫体在2 0 E 刺激后lh 到6h 表 现出强烈上调。lh 上调幅度最大(
10、图5 ) 。 5 重组表达和抗体制各 为了获得多克隆抗体，将H a S e r p i n p E T 3 0 a ( + ) 在大肠杆菌中进行重组表达， S D S P A G E 检测结果显示，有一个约4 7 k D a 的蛋白被诱导表达，分子大小与预期 一致。这个蛋白部分以可溶形式表达，部分以包涵体形式表达。通过亲和柱纯化， 得到了较纯的融合蛋白，用来免疫家兔( 图6 A ) 。 k D a 1 1 6 6 6 一 ：餮”。j 二j 琵 4 5 一一兹毖燃 3 5 一。兹= # 劳￥，自$ * 貔耘荔锄， 2 5 一一。一 1 8 1 4 一 A B 掣孵黪镥嘲。 W w m 黪 “秽
11、Ml2345 图6 H a S e r p i n 在大肠杆菌中的重组表达和抗体检测。A ，泳道l ：诱导前样品；泳道2 ：诱 导后样品；泳道3 和4 分别是破碎后的上清和沉淀：泳道5 ：纯化的重组蛋白。M ，分子量标 准。B ，w e s t e mb l o t 检测抗体特异性。蛋白样品为6 也7 2h 幼虫表皮匀浆液。 F i g 6 A S D S P A G Ea n a l y s i so fr e c o m b i n a n t l ye x p r e s s e dH a - S e r p i ni nE c o l i M m o l e c u l a r w e
12、 i g h tm a r k e r ；l a n el ，t o t a lp r o t e i n so fEc o l iw i t h o u ti n d u c t i o n ；m a i l e2 ，i n d u c t i o nw i t h I P T G ；k3a n d4 ，s u p e m a t a n tp r o t e i n sa n dp e l l e tp r o t e i n sa f t e ru l t r a s o n i c a t i o n ，r e s p e c t i v e l y 5 ，t h ep u r i f
13、 i e dp r o t e i n B D e t e c t i o no fH a s e r p i ni nh o m o g e n a t e so ft h ei n t e g u m e n to f6 恤7 2 h l a r v a e 讨论 我们从棉铃虫中克隆得到了s e r p i n 基因的全长，编码3 9 1 个氨基酸，进化 上与鳞翅目昆虫s e r p i n 接近。 烟草天蛾s e r p i n J 的m R N A 在4 龄和5 龄取食期的脂肪体高表达，但在蜕 J I j 尔大学硕 j 学付论文 皮期和游走期迅速消失( K a n o s te ta
14、1 ，1 9 9 5 ) 。另外，在蓓带夜蛾中s e r p i n ，基因 及云杉夜蛾C f s e r p i n 1 基因也有也有类似的表达模式，在蜕皮间期的表达高于蜕 皮期( S a m u e l se ta 1 ，1 9 9 3 ；Z h e n ge ta 1 ，2 0 0 9 ) 。然而，在本实验中，我们发现棉铃 虫H a S e r p i n 的m R N A 存在于各个组织，但H a S e r p i n 在6 龄变态时期表达量明显 高于幼虫取食期( 图4 ) 。这暗示H a S e r p i n 可能参与变态过程。 烟草天蛾s e r p i n ，在2 0 E 刺
15、激后下调( K a n o s te ta 1 ，1 9 9 5 ) ，而2 0 E 刺激6 龄 6h 幼虫后，H a S e r p i n 的表达显著上调( 图5 ) 。这表明尽管进化一卜比较接近，棉铃 虫H a S e r p i n 可能发挥着与C f s e r p i n - 1 、烟草天蛾s e r p i n J 、蓓带夜蛾s e r p i n J 不 同的功能。并且H a S s e r p i n 可能参与2 0 E 信号途径。具体的作用机制还需深入研 究。 烟草天蛾s e r p i n l 编码1 2 种剪切异构体( J i a n ga n dK a n o s t
16、 ，1 9 9 7 ) ，蓓带夜蛾 s e r p i n - l 基因存在1 0 个剪切异构体( H e g e d u se ta 1 ，2 0 0 8 ) ，云杉蚜虫中S e r p i n 1 也有4 个异构体( Z h e n ge ta 1 ，2 0 0 9 ) 。免疫印迹显示，抗H a S e r p i n 抗血清在表皮 匀浆液中检测到三条带，这暗示棉铃虫中存在3 个s e r p i n 异构体，异构体的序列 和功能还需鉴定。 我们用纯化的重组H a S e r p i n 蛋白检测其抑制活性，结果发现其对胰蛋白酶、 糜蛋白酶和弹性蛋白酶等没有抑制作用。这表明H a S e r p i n 可能不是抑制因子， 没有蛋白酶抑制活性。 叫k 综上所述，我们首次从棉铃虫中克隆得到了一个丝氨酸蛋白酶
