鲎试剂细菌内毒素检查用水

《鲎试剂细菌内毒素检查用水》由会员分享，可在线阅读，更多相关《鲎试剂细菌内毒素检查用水（110页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、细菌内毒素检查法 中国药典2010年版培训班 山东省药品检验所 2010.10 主 要 内 容 n细菌内毒素检查相关理论及概念 n中国药典2010年版增修订情况 n细菌内毒素检查法及注意事项 细菌内毒素检查相关理论及概念 细菌内毒素 鲎试剂 鲎试剂与内毒素的反应机理 细菌内毒素检查 名词解释 细菌内毒素检查法（Bacterial Endotoxins test ） 热原检查法（Pyrogen test） LAL (Limulus amebocyte lysate) Test TAL (Tachypleus amebocyte lysate) Test Limulus Test 细菌内毒素的发现

2、 细菌内毒素这个概念在1890年的 时候就已被提了出来，它是在研究 发热物质过程所引成的，1933年 Boivin最先由小鼠伤寒杆菌提取出 来，进行化学免疫学方面的研究， 到1940年时候，Morgan使用志贺 氏痢疾菌阐明了细菌内毒素是由多 糖脂质及蛋白质三部分所组成的复 合体，到了1950年以后，随着生 物学，物理化学，免疫学以及遗传 学等的进步发展，细菌内毒素的研 究工作，尤其是其化学结构组成及 各种生物活性间的关系也更加明确 起来。 Boivin： Morgan： 内毒素是由多糖、脂质和蛋白质组成的复合体 。脂多糖又由化学和生物性质不同的特异O 抗 原、核心多糖和类脂A（脂质A） 组成

3、。 内毒素的多糖结构 细菌内毒素参考品的建立 n不同细菌的内毒素对于鲎试剂的反应活性不同，为 保证鲎实验法的平行性和重复性，要建立一种内毒 素的标准物质作为实验中的控制标准。 n由于大肠杆菌内毒素在天然内毒素中的致热活性比 较高，在各种细菌内毒素对鲎试剂反应的灵敏性上 处于中值的位置，且其稳定、可溶，因此一般都采 用大肠杆菌的内毒素作为标准内毒素参考品。 标准内毒素与环境内毒素 标准内毒素： 指经人工提取精制并经生物效 价测定的细菌内毒素，作为细菌内毒素检 查的参考品。 国际标准品（IS） 参考标准品 （RSE） 国家标准品（NS/RSE） 标准内毒素 工作标准品 （CSE） 80年代以前以重

4、量作为内毒素的单位 1982年USP20引入以生物效价为量值 的内毒素单位（ EU， Endotoxin Unit ） 细菌内毒素的量值 CP2010年版规定内毒素标准品溶解后要在 旋涡混合器上混合15分钟，以后的每一步稀 释前要至少混合30秒，其他国家药典也有类 似要求； 具有两极活性的内毒素分子在水中呈现不均 匀分布 不按要求进行旋涡混合会使所稀释的内毒素 效价偏低，造成灵敏度标示偏高、阳性对照 不凝等不正确的实验结果 细菌内毒素标准品的稀释 l鲎是一种海洋无脊椎动物，蓝色的血液。 l种类以及分布： 美洲鲎：北美洲东岸海域 中国鲎：中国东南沿海 南方鲎：泰国和马来群岛海域 圆尾鲎：东南亚西

5、部海域 世界上现存鲎的种类 鲎试验的发现 n1956年Johns Hophins 大学动物学家 Frederik. Bang发现革兰阴性细菌的粗制 品能使鲎的血细胞凝聚。 n19631964年 Jack.Levin和Bang对细菌 引起鲎血凝聚进行研究，用内毒素和鲎血 细胞溶解物证明鲎血凝聚机制是一种酶反 应。 n多位学者对鲎血细胞溶解物（LAL）进行 研究，阐释了凝聚机制 鲎试剂：鲎血液变形细胞裂解物冷冻干燥制备而成 鲎试剂的种类： q依据鲎的种类分： n美洲鲎试剂（LAL） n中国鲎试剂（TAL） n圆尾鲎试剂（CAL） q依据检查方法分： n凝胶法鲎试剂和定量法鲎试剂 q依据内毒素和鲎试

6、剂反应的专一程度分： n普通鲎试剂和特异性鲎试剂 鲎试剂与分类 C因子活化的C因子 内毒素 活化的B因子 B因子 凝固酶 凝固酶原 凝固蛋白（凝胶）凝固蛋白原 (1,3)-D-葡聚糖或LAL-RM 活化的G因子 （旁路反应） G因子 二价阳离子 凝胶法鲎试剂与内毒素的反应机理凝胶法鲎试剂与内毒素的反应机理 复杂的酶促反应过程 BET的目的和前提 n确保药品不含有能导致患者发热反应发生的 足量的细菌内毒素。 n一定量的细菌内毒素可以被人体耐受，也是 SFDA允许的。 n 前提是假定引起发热反应的热原几乎全部是 内毒素。 二、2010年版中国药典细菌内毒 素检查法增修订情况 n2010版与2005

7、版区别 n修订背景 n注射用药品、生物制品建立细菌内毒素检 查法指导原则 2010版与2005版区别 2010版2005年版 1、细细菌内毒素检查检查 用水系指内毒素含量 小于0.015EU/ml（用 于凝胶法）或 0.005EU/ml（用于光 度测测定法）且对对内毒 素试验试验 无干扰扰作用的 灭灭菌注射用水 凝胶法细细菌内毒素检检 查查用水系指内毒素含 量小于0.015EU/ml的 灭灭菌注射用水。光度 测测定法用的细细菌内毒 素检查检查 用水，其内毒 素的含量应应小于 0.005EU/ml 2 、本试验试验 操作过过程 应应防止微生物和内毒 素的污污染 试验试验 操作过过程应应防止 微生

8、物的污污染 2010版2005年版 3 、1EU与1个内毒素国际单际单 位（IU）相当 - 4、常用干热灭热灭 菌法（250、 30分钟钟以上）去除 常用的方法是在250 干烤至少 60分钟钟 5、删除对对于过过酸、过过碱或本身有缓缓冲 能力的供试试品，需调节调节 被测测溶 液（或其稀释释液）的pH 值值，可 使用酸、碱溶液或鲎试剂鲎试剂 生产产 厂家推荐的适宜的缓缓冲液调节调节 pH 值值。 2010版2005年版 6、内毒素限值值按L=K/M计计算，M为为人 用每公斤体重每小时时的最大供试试品剂剂 量，以ml/（kgh）、mg/（kgh） 或U/（kgh）表示，人均体重按 60kg 计计算

9、，人体表面积积按1.62m2计计 算。注射时间时间 若不足1小时时，按1小 时计时计 算。供试试品每平方米体表面积积 剂剂量乘以0.027即可转换为转换为 每千克体 重剂剂量（M） 内毒素限值值按L=K/M计计算 ， M为为人用每公斤体重每 小时时的最大供试试品剂剂量 ，以ml/（kgh）、mg/ （kgh）或U/（kgh） 表示，人均体重按 60kg 计计算，注射时间时间 若不足1 小时时，按1小时计时计 算。 7、细节语细节语 言文字方面 凝胶限度试验试验 Antilg 加入内毒素的溶液 处处方 至少2 有任何可能会影响 凝胶限量试验试验 Lg-1 配制内毒素的溶液 配方 不少于2个 发发

10、生了任何可能会影响 修订背景 1、细菌内毒素与检查用水除了强调内毒素含量 外，还强调应对内毒素试验无干扰作用。 2、强调用干热灭菌法（ 250、30分钟以上） 去除内毒素与热原法同步。 3、根据某些药（如抗肿瘤药）用体表面积计算 给药量的需要，增加了按体表面积给药时的计 算方法。 注射用药品、生物制品建立细菌内毒素检 查法指导原则 n本原则依据2010年版药典制订，适用于注 射用药品、生物制品建立细菌内毒素检查 项目时进行的实验及研究。 需建立内毒素检查项目的品种 n质量标准中有家兔热原检查法需转换为细菌 内毒素检查方法的品种。 n用于注射给药，但未有热原质量控制的品种 。 n注射用新药需建立

11、热原质量控制的品种。 n用于静脉给药的原辅料 建立方法时对鲎试剂及样品的要求 n同时使用两个鲎试剂厂家的鲎试剂 n每个品种至少三批样品（上市品种应检测两 个以上生产厂家；新药需检测连续生产的样 品）。 确定内毒素限值 n一般按公式L=K/M计算。M为人每公斤每小时临床最大用药 剂量，依据药品使用说明书，临床用药须知确定。 n儿童用药如大于成人，以儿童为准。 n为保障安全用药，对于抗感染、抗肿瘤、治疗心血管疾病等 重症用的药品、需联合用药的药品，可根据计算值适当调整 ，严格至计算限值的1/2或1/3。 n对于体积在100ml以上（包括100ml）的复方静脉输液类品 种，内毒素限值一般按0.5EU

12、/ml计。其他单方静脉输液品种 除另有规定外也可按用药剂量计算，以EU/mg或EU/U表示 。 n对于美国、欧洲或日本药典已收载的，并已建立细菌内毒素 检查法的品种可参考国外药典规定的限值，与按公式计算出 的数值比较，以严格者为该品种的限值。如果使用的是国外 药典的限值，应以最新版本药典为准。 干扰实验 n建议使用较低灵敏度鲎试剂 (0.5EU/ml 或0.25EU/ml),以避免供试品中内毒素的 阳性影响。 三、细菌内毒素检查法 细菌内毒素检查法 n定义：本法系利用鲎试剂来检测或量化由革 兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试 品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种 方法。 n细菌内毒素的量

13、用内毒素单位(EU)表示。 1、概述 n凝胶法 n光度测定法 浊度法（终点浊度法和动态浊度法） 显色基质法（终点显色法和动态显色法 ） 凝胶法 n最简单、经济、应用最广泛，中国药典的 “仲裁”方法 n对干扰相对不敏感。 n有两倍的误差 n较光度测定法不灵敏 光度测定法 n灵敏（动态浊度检测限0.001EU/ml，动态显 色0.005EU/ml） n检测范围宽（动态浊度达到100EU/ml,动态 显色50EU/ml） n较之凝胶法易受干扰 n对结果的解释更慎重。 实验基本流程图 供试品限值确定 最大有效稀释 倍数确定 供试品干扰实验 正式实验 结果判断 2. 试剂、仪器设备等 细菌内毒素检查法所

14、应用的 试剂，主要包括：鲎试剂、细菌 内毒素检查用水、细菌内毒素工 作标准品等。 国内鲎试剂的生产情况 n安度斯生物技术有限公司 n湛江海洋生物制品厂 n福州新北鲎试剂厂 n厦门鲎试剂厂 n福州东方鲎试剂厂 n福州平潭东方鲎试剂厂 n广西北海鲎试剂厂 n细菌内毒素检查用水 1.药典规定： 凝胶法： 0.015Eu/ml 光度法： 0.005Eu/ml 且对内毒素试验无干扰作用 2. 和鲎试剂配套使用? 细菌内毒素国家标准品(RSE) n细菌内毒素国家标准品系自大肠 埃希菌提取精制而成，用于标定、 复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细 菌内毒素工作标准品的效价。 细菌内毒素工作标准品(CSE) n细菌

15、内毒素工作标准品系以细菌 内毒素国家标准品为基准标定其效 价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核 、干扰试验及各种阳性对照。 仪器设备与实验器具 n分析天平 n超净工作台 n细菌内毒素检查专用干式恒温器 n电热恒温干燥箱 n旋涡混合器 n 实验器具 n 试管架、镊子、消毒棉球、称量瓶 (30mm60mm)、刻度吸管(1、2、5、10、 15ml)、各种试管、中号金属饭盒、加样器等 。 n目前已有多种无热原的一次性用品 实验器具的洗涤与除内毒素 实验中所使用的玻璃仪器清洁与否，直接 影响试验结果。 实验中使用的所有玻璃器具一般经洗液浸 泡后，取出用自来水、 纯化水依次冲洗干 净（可用纯化水浸泡）。 实验

16、器具的洗涤与灭菌 n试验中所用的器皿，需要经过处理，除去可 能存在的外源性内毒素。常用的方法是250 干烤至少30分钟，达到规定时间后，关断电 源，待烤箱温度自然降至室温，一般约需6 8 小时。 n将冲洗干净的试管、称量瓶、玻璃小瓶置金 属饭盒内，吸管置金属筒内，放入烤箱，于 250干烤至少30分钟，放冷，密闭保存备用 。 n灭菌后的实验器具应在规定时间 内使用。 实验器具的洗涤与灭菌 n也可用其他适宜的方法，并应确证不干扰细 菌内毒素的检查。 n除去外源性内毒素的玻璃器皿应在规定内使 用，否则须再次除去可能存在的外源性内毒 素。 n试验操作过程应防止微生物和内毒素的污染 。 3.供试品溶液的配制 n按各药品项下规定，取供试品，精密称定于 称量瓶(事先已除去外源性内毒素)中，按其 效价或含量，用各药品项下规定的稀释剂稀 释至规定浓度，充分摇匀使完全溶解，放置 510分钟，再摇匀,放置备用。 3.供试品溶液的配制 n一般