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1、第六章第七节第六章第七节甾体激素类药物分析甾体激素类药物分析学习要点：1、掌握本章药物的结构特征与分类方法和分析方法的关系2、掌握四氮唑比色法、异烟肼比色法、Kober比色法。3、熟悉本类药物的红外光谱鉴别法和杂质“其他甾体”的检查方法4、熟悉本类药物的其他含量测定方法。第一节基本结构与分类：1、肾上腺皮质激素：可的松、泼尼松、地塞米松皮质酮2、雄性激素及蛋白同化激素：睾酮、甲睾酮、十一酸睾酮、丙酸睾酮、苯丙酸诺龙睾酮苯丙酸诺龙3、孕激素：黄体酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮等4、雌激素：雌二醇、炔雌醇雌二醇炔雌醇5、口服避孕药：炔诺酮、炔诺孕酮、炔孕酮炔诺酮炔诺孕酮炔孕酮三大类激素药物中，肾上
2、腺皮质激素，雄性激素、孕激素结构基本类似，可用于分析的主要官能团有：(结构与分析方法的关系)1甾体母核：浓H2SO4，显色反应24-3酮及C=O：i)与盐酸羟胺、氨基脲缩合，测定其生成物的熔点进行鉴别。ii)与羰基试剂24-二硝基苯肼、异烟肼等呈色。iii)利用在240nm和280nm波长处有紫外吸收。3C17-醇酮基：i)具有还原性，可被氧化试剂如：氨制AgNO3、四氮唑盐、斐林试剂氧化呈色。ii)可与硫酸苯肼作用，经分子重排和缩合形成单苯腙，再与C3位羰基缩合形成双苯腙，呈黄色。4C17-COCH3甲基酮：含活泼次甲基，与亚硝酰铁氰化钠、间二硝基苯反应呈色。5C17-OH：制备衍生物，测m
3、.p.。6C17-酯：酯类反应，水解。7卤素（F-，Cl-）：实行有机破坏后，有F-，Cl-反应。如：F-:肤轻松、氟美松，Cl-:醋酸氯睾酮。雌激素可用于分析的主要结构及官能团有：1甾体母核：显色2A环的酚羟基：Kober反应，与重氮苯磺酸盐偶合反应3C17-OH或酮基；制备酯、腙等衍生物4C17-CCH：与AgNO3氨试液生成白色的炔银沉淀。第二节鉴别试验1、呈色反应：a.与强酸的呈色反应：与硫酸、磷酸、高氯酸、盐酸等呈色b.官能团的呈色反应：i)-醇酮基与许多氧化剂如氨制AgNO3，斐林试剂液、四氮唑盐等反应呈色，其中四氮唑盐的呈色反应最为常用，不仅可作TLC的显色剂，而且也是皮质激素含
4、量测定的依据。ii)4-3酮C3酮基能在酸性条件下与异烟肼、2，4二硝基本肼等羰基试剂反应，缩合成黄色的腙iii)-COCH3能与亚硝基铁氰化钠、间二硝基酚、芳香醛类反应呈色。其中与亚硝基铁氰化钠的反应是黄体酮灵敏、专属而又简便的鉴别反应。在一定条件下，黄体酮显蓝紫色，而其他常用甾体激素均不显蓝紫色，而呈现淡橙色或不显色。Fe(CN)5(NO=CH-CO)iv)C3-OH（酚）与重氮苯磺酸盐的偶合反应。v)氟的呈色反应：2、沉淀反应：a.与碱性酒石酸铜（斐林试剂）的沉淀反应（橙红色沉淀）b.与氨制硝酸银（多仑试剂）的沉淀反应（黑色沉淀）c.与硝酸银的沉淀反应（白色炔银盐沉淀）d.与硝酸-硝酸银
5、的沉淀反应（白色氯化银沉淀）3、制备衍生物测定其熔点：（1）酯的生成：（2）酮肟的生成：（3）缩氨基脲的生成：（4）酯的水解：4、水解产物的反应：5、紫外分光光度法：6、红外分光光度法：7、薄层色谱法8、高效液相色谱法第三节特殊杂质检查一、其他甾体二、游离磷酸盐三、甲醇和丙酮四、雌酮五、硒六、乙炔基主要采用HPLC来检查其他甾体第四节含量测定一、四氮唑比色法（TTC：深红色，BT：暗蓝色）基本原理：C17-醇酮酮基具有还还原性，在碱性溶液中能将四氮唑盐唑盐定量地还还原为为有色甲噆，在可见见光区有最大吸收。讨论：（用于皮质激素的测定）1、基团影响：C11-酮基的反应速度快于C11-羟基甾体；C2
6、1-羟基酯化后较其母体羟基的反应速度慢；当酯化了的基团为三甲基醋酸酯、磷酸酯或琥珀酸酯时，反应更慢。2、溶剂和水分的影响：含水量大时会使呈色速度减慢，但含水量不超过5%时，影响不大，可采用95%乙醇。醛具有一定的还原性，会使吸收度增高，故一般采用无醛醇作溶剂。3、碱的种类及加入的顺序影响：在各种碱中，采用氢氧化四甲基铵能得到满意效果，故最为常用。一般先加四氮唑盐溶液再加碱液较好。4、空气中氧及光线的影响：反应及其产物对光敏感，因此必须用避光容器并置于暗处显色，同时在达到最大呈色时间后，立即测定吸收度。5、温度与时间的影响：一般说来，呈色速度随温度增高加快，一般以室温或30恒温条件下显色，易得重
7、现性较好的结果。二、异烟肼比色法：H+本法主要用于甾体激素制剂的测定讨论:1、溶剂的选择：只有用无水乙醇和无水甲醇才能得到满意的效果。一般多选乙醇。2、酸的种类和浓度以及异烟肼的浓度：当酸与异烟肼试剂的摩尔比为2：1时可获得最大吸收度，若用醋酸，则需将其浓度增大到25%。3、水分、温度、光线和氧的影响：当溶剂中含水量增高时，吸收度随之降低。温度升高，反应加速。当在具塞玻管中不致使溶剂挥发及吸收水分的情况下，光与氧不影响反应。4、关于反应的专属性：具有3-酮-4-烯的甾体激素在室温不到1h即可定量地与酸性异烟肼反应；其他甾酮化合物需在长时间放置或加热后方可反应完全，例如C20-酮化合物反应就很慢
8、。C17-酮化合物也可发生反应并形成腙，C-11酮在上述条件下不发生反应。具有共轭双键的另一些甾酮化合物，在相当长的时间内反应仍不能完全。三、Kober反应比色法：雌激素与硫酸-乙醇共热呈色，用水或稀硫酸稀释后重新加热发生颜色改变，并在515nm附近有最大吸收。第一步：与硫酸-乙醇共热产生黄色，在465nm处有最大吸收；第二步：加水或稀硫酸稀释重新加热显桃红色，在515nm处有最大吸收铁酚试剂：又称铁-柯柏试剂，为硫酸亚铁铵加水溶解后，加硫酸及过氧化氢，再与苯酚混合制成。优点：1、由于加入少量铁盐，能加速黄色形成的速率和强度；加速黄色转变为红色，也能增强红色的稳定性2、酚的加入，可以消除反应中产生的荧光并加速红色的形成四、紫外分光光度法：原理：分子中具有共轭双键结构，紫外又吸收，在一定波长下测定吸收度即可定量。计算：标示量AXVXDXWEX100XWX标示量X100%五、高效液相色谱法：HPLC具有快速、取样量少、准确、灵敏、分离效能高等特点。色谱条件：色谱柱：C18柱流动相：甲醇水、乙腈水计算：采用内标法加校正因子1）校正因子（f）=AsmsArmr2）含量（mx)=fXAxAsms知识回顾知识回顾KnowledgeKnowledgeReviewReview
