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1、第二十一章 药物质量控制中现代分析方法的进展 第一节 毛细管电泳分析法 一、简介 1、定义： 在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电 场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的 电极方向迁移的现象，称之为电泳。 1981年，Jorgenson和Luckas，用75m内径石英毛 细管进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发 生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭 新的分离分析技术高效毛细管电泳。 2、 HPCE的优点： (1) 毛细管中心与外界的距离很短，电泳产生的焦耳热 很快被散去，有效防止电泳条带的扩散。 (2) 分析速度快、分离效率高 (3) 电极液用量少，不破
2、坏生物样品，检测灵敏度高， 用激光诱导荧光检测器灵敏度可达10-19g (4) 结构简单，操作方便，自动化程度高。 二、毛细管电泳仪 三、主要分离模式 1、毛细管区带电泳 主要用于离子状态存在的样品 （1）分离原理 几个基本概念： n偶电层 (Electric Double Layer，简称EDL) n电渗流：在高电压下，由于液固界面的双电层的存在，组成 扩散层的阳离子向负极移动，导致毛细管中的溶液整体向负 极移动。这种现象称为电渗流，用EOF表示,其速度表示为 eo表示。 n电泳淌度：溶质在给定缓冲溶液中，单位时间在单位电场下 移动的距离。用ep表示，其速度用ep表示。 n表观淌度 ap：实
3、际测得的电泳有效淌度和电渗流淌度 的矢量和 ap= ef+ EOF n表观迁移速度：离子在实际分离过程中的迁移速度 ap=ap E （2）各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为： + =电渗流 + +ef 阳离子运动方向与电渗流一致； - =电渗流 - -ef 阴离子运动方向与电渗流相反； 0 =电渗流 中性粒子运动方向与电渗流一致； 2、胶束电动毛细管色谱（MECC） 主要用于电中性物质的分离 n分离原理：在缓冲溶液中加入离子型表面活性 剂，形成胶束，被分离的物质的水和胶束两相 分配，各溶质因分配系数差异而被分离 n3、毛细管凝胶电泳（CGE） 是毛细管自由溶液区带电泳派生出的一种电 泳方式
4、，用多孔性的凝胶或其它筛分剂作 介质，网状结构，按分子的大小分离。主要 用于分析蛋白质、DNA等生物大分子。 4、毛细管等速电泳 5、毛细管等点聚焦电泳 6、毛细管电色谱（CEC) CE与HPLC的有机结合。CEC可看成是CZE的 空毛细管被色谱固定相填充、涂布或键和的 结果，在毛细管两端加高压直流电压，以电 渗流代替高压泵推动流动相。 第二节 质谱（Mass Spectrum, MS） 定义：质谱法是通过将样品转化为运动的气态离子并按 质荷比(MZ)大小进行分离并记录其信息的分析方法。 第二节 超高效液相色谱及其应用 一、超高效液相色谱（ ultra performance liquid c
5、hromatography, UPLC) 一种基于小颗粒填料的液相色谱技术。 n 要求：高效快速的分析 n 对液相色谱技术的要求也不 断提高，单从技术角度的改进 已经不行，或者说必须从理论 高度对液相色谱重新认识。由 此，UPLC（超高效液相色谱） 概念得以提出，将HPLC的极限 作为自己的起点。 二、理论基础 n在高效液相色谱速率理论中， Van Deemter方程 式的简化表达式： n如果仅考虑固定相的粒度 对 的影响，其简化方 程式可表达为： 首先颗粒度越小柱效越高；其次每个颗粒度尺寸有自己的最佳柱效的流速；最后， 更小的颗粒度使最高柱效点向更高流速（线速度）方向移动，而且有更宽的线速度
6、 范围。所以降低颗粒度不但提高柱效，同时也提高速度。使用更高的流速会受到色 谱柱填料耐压及仪器耐压的限制。反之，如果不用到最佳流速，小颗粒度填料的高 柱效就无法体现。另外，更高的柱效需要更小的系统体积（死体积）、更快的检测 速度等一系列条件的支持，否则小颗粒度填料的高柱效同样无法充分体现。 要真正创建一个全新的分离科学领域 UPLC，必须 解决以下问题： 1）要解决小颗粒填料的耐压问题，第二要解决小颗粒 填料的装填问题，包括颗粒度的分布以及色谱柱的结 构。 2）高压溶剂输送单元（超过15000psi）。 3）完善的系统整体性设计，降低整个系统的体积，特 别是死体积。并解决超高压下的耐压及渗漏问
7、题。 4） 快速自动进样器，降低进样的交叉污染。 5）高速检测器；优化流动池以解决高速检测及扩散问 题。 6）系统控制及数据管理，解决高速数据的采集、仪器 的控制问题。 三、UPLC技术与特点 （1）新型色谱填料及装填技术 杂化颗粒技术（Hybrid Particle Technology HPT ） Waters公司的ACQUITY UPLCTM使用了更严格的筛分 技术使1.7祄填料的分布很窄 ，并且使用了全新筛板（专利 申请中）及其他色谱柱硬件（ 柱管及其连接件），在超过 20000psi的压力下装填。 （2）超高压液相色谱泵 （3）自动进样器 为了降低死体积、减少交叉污染，自动进样器的设
8、计使用了 许多新技术，例如针内针样品探头、压力辅助进样等等。 n减少死体积，降低谱 带扩展 n快速自动取样 n低扩散、低交叉污染 外针刺破密封，内针插入样品容器底部吸取样品可达到微 量取样（L取样） （4）高速检测器 UPLC光导检测器流通池示意图 四、UPLC的特点 分析速度快 灵敏度高 分离度好 超 高 效 液 相 色 谱 的 优 点 0.00 0.04 0.08 0.12 0.16 0.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.00 1. Thiourea - 0.430 2. toluene - 1.034 3. propylben
9、zene - 1.742 4. butylbenzene - 2.413 5. hexylbenzene - 5.058 样品的组份数：5 5m颗粒度 完全分离时间：6.00分钟 0.20 0.24 1. Thiourea - 0.046 2. toluene - 0.088 3. propylbenzene - 0.137 4. butylbenzene - 0.182 5. hexylbenzene - 0.360 UPLC AU 0.00 0.10 0.20 Minutes 0.050.100.150.200.250.300.350.400.450.500.550.60 UPLC HPL
10、C 样品的组份数：5 1.7m颗粒度 完全分离的时间：0.60分钟 UPLC的速度提高了！ 增加了样品 的通量 0.00 AU 使用1.7m颗粒度的填 料增加灵敏度 可看到更多 的样品信息 AU 0.000 0.004 0.008 0.012 0.016 0.020 Minutes 1.701.801.902.002.102.202.302.402.502.60 1.7 m AU 0.000 0.010 0.020 0.030 0.040 0.050 Minutes 0.001.002.003.004.005.006.007.008.00 AU 0.000 0.010 0.020 0.030
11、0.040 0.050 5.0 m 0.024 恒定柱长时；UPLC的灵敏度提高1.7倍（170%）！ n示例： 第三节 手性HPLC技术与应用 一、手性药物拆分的高效液相色谱法分类 1. 间接法拆分对映异构体即衍生化试剂法（ CDR） 2. 直接法拆分对映异构体 手性固定相法（CSP） 手性流动相添加剂法（CMP） 采用非手性固定相 二、拆分原理及特点 1. CDR (R) SE + (R) SA (R) SE (R) SA (S) SA (R) SE (S) SA n手性衍生化特点： 1.需要高光学纯度的手性衍生化试剂； 2.反应繁琐费时； 3.衍生化反应速率重现性较差 4.只需使用价格便
12、宜、柱效较高的非手性柱 5.衍生化过程可同时纯化样品 2. 手性流动相拆分法（CMP） 又称手性添加剂法，这种拆分法是在流动相中加 入手性试剂，利用手性试剂与各对映体结合的稳定常 数不同，以及药物与结合物在固定相上分配系数的不 同来进行分离。 优点：优点：此法不需昂贵的手性柱，亦无须进行柱 前衍生，手性添加剂可视要求而更换，使用比较方 便。 其中主要应用的有：配体交换型手性添加剂、环 糊精添加剂、手性离子对添加剂。 3. 手性固定相拆分法（CSP） 利用手性固定相与对映体消旋物相互作用， 其中一个与手性固定相生成不稳定的短暂的对映 体复合物，使两种异构体在色谱柱上的保留时间 不同，从而得到分离
13、。 用于色谱分离的手性固定相已经被大量研究， 已有100多种液相色谱固定相被商业化。目前所研 究的高效液相色谱手性固定相有 7大类。 其中主要应用的有：Pirkle型CSP、环糊精CSP 、手性聚合物CSP、蛋白质CSP 。 CSP种类作用机理应用 Pirkle型 CSP 主要有 -碱型（带带推电电子取代基 ）手性固定相、-酸型（带带吸电电子取 代基）手性固定相，以及氨基酸类类手 性固定相 氨基酸、 乙内酰脲酰脲 、 内酰脲酰脲 、 胺类类、 醇类类及硫醇类药类药 物对对映 体 拆分 环环糊精CSP 环环糊精的手性识别识别 主要来自环环内腔 对对芳烃烃或脂 肪烃类侧链烃类侧链 的包容作 用，
14、以及环环外壳上的羟羟基与药药物对对 映体分子发发生氢键氢键 作用 一环环糊精：适用于大多数药药物 一环环糊精：适用于相对对分子质质 量小于200的药药物 一环环糊精：适用于较较大相对对分 子质质量药药物 手性聚合物 CSP 一类：天然的多糖衍生物纤维素和 直链淀粉 另一类：高分子化合物 对对醇、酸、酮酮、酯酯、含P或S的 药药物有良好的手性识别识别 能力 。 蛋白质质CSP 可识别药识别药 物对对映体在蛋白质质的结结合 位点而达到手性分离 可直接分离许许多药药物，如硫喷喷 妥因、 心得怡及阻滞剂剂等 CSP的特点 1.适用范围广 2.制备分离方便 3.定量分析的可靠性高 4.价格昂贵 第四节
15、色谱-质谱联用技术 主要问题有两大方面： 1、如何实现接口，降低压力使色谱柱的出口与 质谱的进样系统连接，达到两部分速度的匹配 ； 2、除去色谱中大量的流动相分子。 n分子分离器连接 （主要用于填充柱） 从气相色谱来的载气和样品离子经一小孔加速喷射入喷射腔中 ，小分子的载气由于扩散速度较快，被真空泵抽除，而被测物 分子量大将在惯性作用下继续直线运动而进入捕捉器。 n直接连接法（主要用于毛细管柱） 在色谱柱和离子源之间用长约50cm，内径0.5mm的不锈钢毛细管 连接，色谱流出物经过毛细管全部进入离子源，这种接口技术 样品利用率高。 n开口分流连接 该接口是放空一部分色谱流出物，让另一部分进入质
16、谱仪，通 过不断流入清洗氦气，将多余流出物带走。此法样品利用率低 。 一、气相-质谱联用（GC-MS） 二、液相色谱-质谱联用(LC-MS) n关键是LC 和MS 之间的接口装置。 n目前广泛使用的是大气压电离(Atmosphere pressure Ionization，API)源包括: A. 电喷雾电离(Electrospray Ionization，ESI)源 B.大气压化学电离(Atmospheric Pressure Chemical Ionization，APCI) 电喷雾电离源（ESI) 电喷雾离子化分为三个过程: 形成带电液滴 溶剂蒸发和液滴碎裂 形成气相离子 毛细管2-4kV 离子从液滴表面 蒸发出来 - - + + + - + + + + - 含各种离子的液滴 - - + + + + - - - - - + + +- - + + + + - - - - - + + +- 随着液滴的挥发,电荷密度增 大, 离子集中到液滴
