《常用中药的生物鉴定-pcr》由会员分享，可在线阅读，更多相关《常用中药的生物鉴定-pcr（46页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、常用中药的生物鉴定 之聚合酶链式反应 常用中药的生物鉴定方法 免疫鉴定法 电泳鉴定法 生物效价鉴定法 单纯指标鉴定法 细胞生物学鉴定法 DNA遗传标记鉴定法 mRNA差异显示鉴定法 聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction)， 简称PCR，是一种分子生物学技 术，用于放大特定的DNA片段。 可看作生物体外的特殊DNA复制 。 少量DNA 样品快速扩 增amplify技术。 (invented by Kary Mullis , won a Nobel Prize in Chemistry in 1993 ) 原 理 PCR 要 件 模板Template 引物 Prim
2、ers: Small pieces of DNA. Made up of 15 to 30 bases. Binds the DNA at a specific region. forward and reverse 正向和逆向 酶Enzyme: Taq DNA polymerase PCR核酸Nucleotides: Substrate, four deoxyribonucleotides (A,C,G,T) dNTP M Dist H2O117 ul 10X buffer 15 ul dNTP12 ul Primer 13 ul Primer 23 ul Taq polymerase 0.
3、75 ul 200ul tube Pipette 上下混合 取出15 ul 剩下的加入3 ul Template DNA 用pipette 上下混合 分装入tube 15ul/支 标上1.5 1 2 3 45 54C 56 58 60 62 Run PCR Tc Tc 55 C 不加模板的对照组 M 加入 1 ul 模板DNA 不加引物但有模板的对照 Pc 15 ul M TC 3 ul template (T) Pipette mix TC 15ul/tube pc PC 12 345 1 ul template T TCPC12345 54 55 56 57 58 60 62oC RNU
4、Program Denature 95C 5 min Denaturation变性：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA，一般加热至90 95, 30 sec Annealing褪火：系统温度降低，引物与DNA模 板结合，形成局部双链，5570，固称其为褪 火。 most important factor in the PCR ,45sec Extension延伸：在Taq酶的作用下，以dNTP为 原料，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补 的DNA链, 温度为7075C, 1.5 min Final extension 72 C, 5 min 2x106 优点: need v
5、ery small amount of sample 缺点: amplified product may be contaminated with other samples not related to the one Factors affect to PCR vMg +2 concentration, Mg +2 specificity 0.15mmol/L Mg+2 预实验 vPrimer(引物) specificity Degenerate primer -to find the target gene in the closely related species specifici
6、ty , nonspecific products vAnnealing Temperature Too high no PCR product Too low much nonspecific product gradient Temp PCR machine find the suitable Temp vTaq polymerase quality vTemplate(模板) DNA quality PCR产物鉴定 Agarose gel electrophoresis to check product 1.5% Agarose in TAE buffer (17 ml) boil Po
7、ur into the tray (assembled gel apparatus) After PCR amplification Agarose gel electrophoresis to check product 1.5% agarose in 17 ml TAE ( 4mm thick) 5 ul product add 1 ul 6X loading dye mix 1Kb marker 2.5 ul 100 V run 25-30 min EB stain 10 min(EB致癌物, 戴手套) , photograph 1.5 1.0 0.5 0.2 Kb 10 gamma p
8、rimer Mismatch 3 base 10 gamma primer complete match PCR的应用 1.detection genetically modification organism (GMO )检测转基因生物，找出特异的基因或片 段 find specific gene or fragment (promoter) 2.uncultured microorganism 3.pathogen identification 4.detection insertion sequence (cloning) 提取模板 反应体系配置 PCR扩增 电 泳 引物设计 乌梢蛇为中
9、国药典(2010版)一部收载的一种常用中 药，来源于游蛇科动物乌梢蛇Zaocys dhumnades(Cantor)的 干燥体。有祛风、通络、止痉之功效。用于风湿顽痹、麻木 拘挛、半身不遂、抽搐痉挛、瘰疠恶疮。 商品流通中多以红点锦蛇、黑眉锦蛇、玉斑锦蛇、王锦 蛇、灰鼠蛇等来混作正品药材进行销售，这些品种多数与乌 梢蛇同科不同属，因其来源相近，造成鉴定困难。此外，药 材在加工处理时剖去内脏后，要进行干燥熏黑处理，皮上的 花纹特征、颜色几近消失，难以辨认，而且其大小、形态特 征与乌梢蛇相近，这是造成其性状鉴别困难的另一重要原因 。 鉴于乌梢蛇作为中药的临床功效确切，但商品来源复杂 、药材性状鉴别
10、困难的现状，为满足目前市场常见混伪品的 鉴别要求，寻找经济实用、准确便捷、稳定性高的方法，应 用高特异性PCR方法对乌梢蛇药材及其混淆品的原动物和炮 制品进行鉴别。 高特异性PCR方法鉴别乌梢蛇及其混淆品 功效：祛风、通络、止痉。 市售混淆品：红点锦蛇、黑眉锦蛇、 玉斑锦蛇、王锦蛇、灰鼠蛇等 乌梢蛇高特异性 PCR鉴别引物的设计 从GenBank下载正品原动物乌梢蛇及混 伪品线粒体12S rRNA基因序列 经DNAMAN软件对位排列分析正、混品 间DNA序列差异，设计出一对能特异性 扩增乌梢蛇12S rRNA基因片段的特异 性鉴别引物HWL-1和HWH-1 （上海生工生物合成公司） 模板DNA
11、的提取 基本要求是除去杂质，并部分纯化 标本中的核酸。多数样品需要经过 SDS和蛋白酶K处理。所得到的粗制 DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用 乙醇沉淀后用作PCR反应模板。 特异性PCR鉴别 反应体系： Tris-HCl 10mmol/L 氯化钾 50mmol/L Mg2+ 1.5mmol/L dNTP 0.15mol/L Taq 1U(40ml) 引物 0.15mol/L 模板DNA 50ng 步骤步骤 预变性预变性 95C95C4 4 min min 变性变性 95 C95 C 40 40 sec sec 褪火褪火 65 C65 C 1min 1min 延伸延伸 72 C 72 C 30sec30sec 延伸延伸 72 C72 C 5 min 5 min 设置无设置无DNADNA模板的阴性对照模板的阴性对照 通用引物构成的阳性对照通用引物构成的阳性对照 25cys 琼脂糖凝胶电泳 取5l反应液经1.8%琼脂糖凝胶电泳 EB染色 紫外凝胶分析检测 成像 结 果 模板质量研究 （1234为正品） 高特异性PCR鉴别的研究 个体差异的研究 炮制品特异性的研究 PCR在其他中药中领域的应 用 中药材蛇胆的DNA分子标记鉴定研究-南 京师范大学遗传资源研究所-王义权教授 中药材蛤蟆油PCR鉴定-王义权 鹿类中药材的位点特异性PCR鉴定研究- 王义权
