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1、孙兵 王逸平 李澄宇 金颖 杨晟 王勇（杨琛） 鲍岚 于翔 金玫蕾 于翔孙兵1、 请比较说明三种主要制备人源化抗体方法的优缺点（04）2、 单克隆抗体的制备原理和人源化抗体的分类及其主要应用（08）3、 说明从杂交瘤中，分离单克隆细胞的方法。（07）王逸平1、 简述受体概念，特点，功能，并举例说明受体与配体结合试验的测定方法，以及放射配体结合法的应用。（04、05）答案：1）概念：受体是细胞在进化过程中形成的细胞蛋白组分，是一种能够识别和选择性结合某种配体（信号分子，周围环境中某种微量化学物质）的大分子，通过信号转导作用与放大系统，将胞外信号转换为胞内化学或物理的信号，触发随后的生理反应或药理
2、效应，即表现为生物学效应。受体存在于细胞膜、胞浆、细胞核中，类型包括：门控离子通道型受体，G蛋白偶联型受体，具有酪氨酸激酶活性受体和细胞内受体等。受体与配体的结合是化学性的，二者通过范德华力、离子键、氢键等分子间的吸引力结合。2）特点：受体一般至少包括两个功能区域，与配体结合区域及产生效应区域，分别具有结合特异性和效应特异性。其特点有1特异性：对配体具有高度选择性，这种选择性是由分子的几何形状决定的，与其在空间结构上互补，但并不是简单的一对一关系，不同细胞对同种配体可能具有不同受体。2饱和性：受体在生物体内的数量是有限的，与其配体的结合能力有限。受体配体结合曲线（Scatchard曲线）为矩形
3、双曲线，增加配体浓度，可使受体饱和。3可逆性：受体与配体结合后可解离，可置换。4高亲和性和敏感性：受体具有极高的识别能力。5特定的作用模式：受体在细胞内分布，从数量到种类，均有组织特异性，并有特定的作用模式，提示某受体与配体结合后，能引起特定的生理效应。3）功能：1识别和结合2信号转导3产生相应的生理功能4）受体与配体结合试验的测定方法1受体与配体结合试验常用放射性配体结合法(RBA)进行测定，放射配体结合法原理为：利用受体和配体结合的高度特异性以及放射性核素测量的高灵敏度的特点, 用放射性核素标记配体, 在一定的条件下, 使其与受体结合, 形成受体-配体复合物, 通过测量此受体-配体复合物的
4、放射活性, 达到了解受体结合活性的目的。如已有报道采用放射配体受体结合分析法观察川芎嗪对VEGF受体（VEGF为血管内皮生长因子，被认为是座用最强、特异性最高的血管生长因子之一）最大结合容量(Bmax )和解离常数( Kd 值)的影响。说明在川芎嗪作用下VEGF受体数目下降，结果显示川芎嗪大剂量组含药血清抑制VEGF受体与125 I-VEGF结合,提示川芎嗪可能是通过抑制VEGF受体结合而发挥其抑制血管生成的作用。（丰俊东,徐晓玉等，中国药理学通报，2005 Aug; 21 (8) : 939）以及用此分析法进行铁蛋白受体特性研究，结果表明铁蛋白受体与铁蛋白结合具有高度特异性，可饱和性和中度亲
5、和力。在观察川芎嗪对VEGF受体最大结合容量(Bmax )和解离常数( Kd 值)影响的研究中放射配体受体结合实验(RBA)具体步骤如下：胰蛋白酶消化细胞,离心去上清。用结合缓冲液( RPM I 1640 培养液含0.1% BSA, 20 mmol Hepes, pH = 7.4)调整细胞密度至6 105 ，将细胞悬液加入1-24号检测管中，每管150L。检测管在使用前用PBS (含1%BSA)浸泡过夜。复管法分别加入125 I-VEGF 50、80、100、150、200、350、500、700 pmolL - 1至1-16号检测管。非特异结合管( 17-24 号)按复管法分别加入125 I
6、-VEGF 50、100、350、700 pmolL 1，并加入100倍的非标记VEGF。上述各管再加入结合缓冲液至总体积300 L,置于4,孵育3 h。加入1 ml冰冷PBS(含011% BSA)终止反应，离心弃上清，细胞用冰冷的PBS(含0.1% BSA)洗3次。置于计数器(GC-911)测量放射性。总结合减去对应浓度点非特异性结合得出特异性结合的cpm值。RBA专用分析软件处理数据,得出受体最大结合容量(Bmax )和平衡解离常数( Kd ) ,绘出饱和曲线,并进行Scatchard作图。2亲和磁共振法（affinity NMR），它的基本前提是当配体与受体结合时,该低分子量配体的扩散速
7、率发生明显的变化,其结果是结合和非结合配体的扩散系数明显不同,从而允许采用PFG实验（PFG实验常用于测定分子的扩散系数），从该配体和众多与靶蛋白无结合作用的分子的混合物中对该配体进行识别。该方法已经成为研究小分子配体和生物大分子相互作用的一种非常重要的手段。可检测小分子配体信号在作用过程中的变化以识别药物分子，是核磁共振进行药物筛选的主要方法之一。但与其他技术相比，NMR 方法在筛选混合物中的应用受到其相对不灵敏的限制。3原子力显微技术（atomic force microscopy,AFM）。该技术可提供在内力及外力影响下受体-配体之间相互作用的动态变化信息。AFM是作为一种成像工具而设计
8、的，还能以力扫描方式进行操作。在这种力模式下，它能以10-12牛顿的精度测量两相对表面之间的作用力。在受体-配体间作用力的研究中，配体被偶连于的AFM弹性悬臂表面，受体则被固定于适当的基底表面。在悬臂接近和离开基底的过程中，通过悬臂的偏折便可测得受体-配体间的作用力。 AFM作为检测受体-配体间相互作用的一种超高灵敏度的力传感器，已应用于对生物素-链亲和素复合物之间作用力的测量，红细胞的亲和力成像，钙离子通道识别，活体细胞上钙通道拮抗剂与受体之间结合力的测量等研究中。5）放射配体结合法的应用领域1,阐明药物作用机制;2,新药设计和药物筛选;3,探讨疾病的病因,发病机理,提高临床合理用药和诊断水
9、平;4,测定组织或血液中药物浓度;5,探寻新的受体,受体亚型和内源性配体.李澄玉1、 什么是电生理技术？开展膜片钳技术需要哪些常用设备（requirements）?（04）答：Electrophysiology deals with different techniques of analyzing electrical signals (current and potential changes) generated at cell membranes, or with techniques where electrical stimuli are guided to the membran
10、e to analyze their influence on membrane transport and function. 膜片钳技术需要的常用设备：一套膜片钳系统可分为机械系统，光学系统和电子系统。其中机械系统包括防震平台和微操作器；电子系统包括放大器，刺激器，数据采集，纸带记录，示波器，拉制仪，抛光仪等；光学系统包括成像系统（摄像头，边缘检测，荧光检测，图像显示，监视器等）和显微镜。2、 解释GABA激活神经元的Cl通道为什么既可引起超极化反应,也可引起去极化反应？（05）在神经元发育的早期，胞内的Cl-浓度要大于胞外，此时如果GABA激活离子通道型受体GABAa，引起GABAa的开
11、放则Cl-将沿化学浓度梯度从胞内流向胞外。在静息水平，神经元膜电位为负值即胞外侧积累了较多的正电荷，所以Cl-的大量外流势必会中和胞外的正电荷从而使膜电位上升引起去极化反应；在神经元发育成熟以后，胞内的Cl-浓度会由于一种transporter表达量的上调而低于胞外，这样，当GABAa开放时Cl-从胞外流向胞内引起细胞膜内侧负电荷的增多，膜电位降低引起超极化反应。3、 解释翻转电位及意义反转电位是一类离子通道在特定离子浓度下的特征性参数，反转电位的获得主要通过对单一种类的离子通道进行电压钳单通道记录，具体就是在电压钳模式下给具有单一种类离子通道活性的细胞一系列膜电位钳制，记录不同膜电位下某种离
12、子通过通道引起的电流，从而得到该种通道的I-V曲线，反转电位就是当电流为0时对应的膜电位。因为在离子通道开放后，离子流动的方向由胞内外该离子的浓度梯度及电势梯度共同决定，对钠离子而言，在膜电位较低时浓度梯度会驱使钠离子内流，当膜电位不断升高时受电势梯度影响内向电流逐渐减小到0，甚至出现外向电流。对于不同种类的离子通道而言，离子浓度不变时反转电位是特定的，因此研究某种通道的反转电位有助于通过与已知通道特性的比较确定该通道的类型。4、 电生理方法？膜片钳全细胞记录的优点？（08）答案：一、电生理方法：1、细胞外记录：特殊的电极：尖端是碳纤（可放到膜的周围），1个电极放在细胞上，另一个电极放在很远的
13、地方（如皮下组织），作为一个参考电极。 测出2个电极之间电压的差别，从而知道细胞外电位的变化。电极的碳纤放在中间，周围包裹了一些像玻璃管一样的东西，当记录到细胞的膜电位后，通过细胞周围这些玻璃管往局部的组织内给予一些药物，如一些受体的阻断剂，看看神经元会有一些怎样的反应。2、细胞内的记录（一般指尖电极记录）： 细胞在组织液中，电极往细胞里扎，因静息膜电位为负，在电极还在细胞外的时候，把细胞外参考电极的电位调到0，当测量电极插入细胞时，电位显示一下变为负，便知道电极扎入细胞。电极扎入细胞分为2种：1、 较原始：电极接触到膜后阻抗变大，敲击实验台使电极扎入细胞。2、 电极接触到膜后阻抗变大，给一个
14、过补偿电流（玻璃电极内外都有电解质，也为一个电容，会充放电，需要给予补偿电流），使电极尖端振动，频率较高，使电极扎入细胞。（过补偿电流使电极尖端振动原理还未知） 细胞内记录可记录到膜电位的波动（如神经元突触后电位和动作电位），而细胞外记录只能记录到锋电位的变化。3、膜片钳记录的不同方式： 1）、细胞吸附式记录(cell-attached patch)电极向细胞靠近时，给一个正压，使电极往外“吹”，当靠近细胞后去掉正压，使得细胞膜与玻璃之间形成一个非常紧密的高阻抗封接，使从缝隙外泄的电流非常小（电阻非常大）。在细胞膜表面隔离出一小片膜, 即通过微管电极对膜片进行电压钳制, 从而测量膜电流。可在电
15、极液中加入药物等物质，研究其对膜上离子通道（如配体门控通道）的作用，缺陷在于1次patch只能测定1种物质浓度对膜上通道的作用。2）、全细胞记录：形成高阻抗封接后，给予一个非常短促的负压，使膜被吸破，电极内的溶液和细胞里的溶液导通，就能记录到细胞膜电位的变化，为全细胞记录。全细胞记录模式可应用于记录：神经元上某些通道和受体的电信号神经元PSC突触后电流神经元PSP突触后电位 神经元AP动作电位3）、内面向外模式( inside-out patch) cell-attached后高阻封接形成, 将微管电极轻轻提起, 使其与细胞分离, 电极端形成密封小泡, 在空气中短暂暴露几秒钟后, 小泡破裂再回到溶液中, 使小泡的外半部分破裂得到一小片膜，且膜的细胞外的这一面对的是电极液，而细胞内的这一面对的是细胞外溶液，就是所谓的inside-out patch。由于细胞膜的内面朝向外部溶液，可以调节细胞外溶液中的成分来研究改变膜上离子通道的细胞内环境对膜造成的影响，如研究一种配体在细胞内与受体连接激活膜上离子通道，研究其不同浓度对通道的激活作用。但无法研究细胞外环境改变对膜上通道的影响。4）、外面向外模式(outside-out patch)阻封接形成后, 继续以负压抽吸, 膜片破裂, 再将玻管慢慢从细胞表面提起,
