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1、WenZhou Medical CollegeWenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院 WenZhou Medical CollegeWenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院 人外周血单个核细胞总RNA的分 离纯化及其逆转录 WenZhou Medical CollegeWenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院 WenZhou Medical CollegeWenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院
2、检验医学院、生命科学学院 外周血单个核细胞分离原理 人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）包括淋巴细胞和单核 细胞。 单核细胞的体积、形态和比重与外周血其他细 胞不同，因此利用一种介于1.075-1.090之间的 聚蔗糖-泛影葡胺（ ficoll-hypaque ）分离液作密 度梯度离心，离心后不同比重的血细胞在分离液 中呈梯度分布，从而分离出PBMC. WenZhou Medical CollegeWenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院 WenZhou Medical Col
3、legeWenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院 实验步骤 人外周血单个核细胞的 分离： 1.吸取2ml淋巴细胞分离液加 入玻璃试管； 2.取抗凝血1ml，用1ml生理 盐水稀释混匀，然后沿管 壁缓慢加入淋巴分离液（ 上层为抗凝血，下层为淋 巴细胞分离液）； 3. 2500rpm，离心15min(沉 降系数不同，而分离出单 核细胞)； WenZhou Medical CollegeWenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院 WenZhou Medical CollegeWenZhou
4、Medical College 检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院 4. 吸取出最上层血浆（弃用），再吸取单核细胞层 至一新的试管中，加生理盐水至管口1cm处，混匀 后离心，2500rpm,5min； 5.去上清（弃用），加生理盐水0.5ml 吹打混匀后 ，转入1.5mlEP管中，2500rpm,5min； 6.去上清（弃用），留细胞沉淀于Ep管中于下一步 总RNA的提取。 WenZhou Medical CollegeWenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院 WenZhou Medical CollegeWenZhou M
5、edical College 检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院 RNA提取原理 真核生物，绝大多数基因含有内含子，因此不易 直接由基因组克隆目的基因，提取RNA并逆转录形 成cDNA是获得真核生物基因的主要手段 RNA极易降解，因其RNA酶分布广、活性强、且难 以失活，痕量的RNA酶就能够造成严重的RNA降解 ，实验中采用多种措施抑制RNA酶的活性，减少 RNA的降解。 WenZhou Medical CollegeWenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院 WenZhou Medical CollegeWenZhou Me
6、dical College 检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院 酸性酚法抽提RNA 其原理是，苯酚在酸性条件下既可溶解DNA ，又是蛋白变性剂，联用氯仿可使细胞裂 解以及蛋白质与RNA分离，最后利用异丙醇 沉淀核酸，获的纯化的总RNA。 WenZhou Medical CollegeWenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院 WenZhou Medical CollegeWenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院 抑制RNA酶活性的试剂 1. 焦磷酸二乙酯（DEPC)，一种
7、强烈的烷化剂， 能够和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而以 抑制外源RNA酶。 2. 异硫氰酸胍，一种强蛋白变性剂，可使包括 RNA酶在内的所有酶活性丧失 抑制外源性RNA酶 活性。 WenZhou Medical CollegeWenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院 WenZhou Medical CollegeWenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院 u单核细胞中总RNA的提取 1.在上述Ep管中加入500l变性液（TRIzol:苯酚 +异硫氰酸胍）、悬浮细胞，加100 l
8、氯仿，强 烈震荡或置漩涡混合器上混匀，冰浴5min. 2.4,12000rpm,离心20min。吸取上层无色水相 转入另一1.5mlEP 管中，加入等体积异丙醇，室 温放置10min。 3. 4 12000rpm,离心20min,去上清，加入500 l 70%乙醇（不吹打） 4 12000rpm,离心 15min，去上清，烘干。 4.加10 l DEPC(焦磷酸二乙酯）水溶解RNA。 基因组 DNA 水 相 有机 相 RNA 氯仿 纯 化 pH5.7 离心 加入裂解液 (TRNzol-A+) WenZhou Medical CollegeWenZhou Medical College 检验医学
9、院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院 WenZhou Medical CollegeWenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院 注意事项 预防RNase污染 1 人的唾液中含有大量RNase，皮肤中含有RNase和细 菌，而霉菌有可能成为RNase来源。 2 要使用灭菌的RNA专用的塑料制品，避免交叉污染 。 3 RNA在TRIzol中不会被RNase污染，我们要注意后续 的实验中要使用不含有RNase的塑料制品和玻璃器 皿。 WenZhou Medical CollegeWenZhou Medical College 检验医学院、生命
10、科学学院检验医学院、生命科学学院 WenZhou Medical CollegeWenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）原理 提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作 为模板，采用Oligo(dT)或随机引物，利用逆转录 酶特异性地反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行 PCR扩增，而获得目的基因。转录产物具有连续的 氨基酸编码区，不需要进行剪接，可在原核细胞 中表达。 WenZhou Medical CollegeWenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院检验医
11、学院、生命科学学院 WenZhou Medical CollegeWenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院 完整的逆转录反应体系除需要逆转录酶、适当的 反应缓冲液。RNA模板、逆转录酶及四种脱氧核糖 核苷三磷酸（dNTP）外，还需加入RNase抑制剂。 本实验利用人外周单个核细胞中RNA逆转录成 cDNA，然后再以此cDNA为模板，利用特异性引物， 通过PCR选择性扩增细胞因子的cDNA序列。 WenZhou Medical CollegeWenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院 W
12、enZhou Medical CollegeWenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院 逆转录 反应体系： MgSO4 2 ml 2*bcastBuffer 5 ml dNTP 0.5 ml RNasin 0.25 ml Random primer 0.5 ml 样品总RNA 1.25 ml 总体积 10 ml RT-PCR扩增细胞因子mRNA 反应条件： 65oc 1min 30oc 5min 30oc-65oc 15min-30min(匀 速升温） 98oc 5min 5oc 5min WenZhou Medical CollegeWe
13、nZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院 WenZhou Medical CollegeWenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院 反应体系： 10*Buffer 2 ml Mg2+ 1.5 ml dNTP 2 ml cDNA 5 ml Taq 0.2 ml primer 2 ml ddH2O 17.3 ml 总体积 30 ml 反应条件： 94 5min 94 45s 56 30s 72 30s 72 5min 4 保存 30c PCR扩增 WenZhou Medical CollegeWenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院 WenZhou Medical CollegeWenZhou Medical College 检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院 结果与分析 PCR产物进行琼脂糖电泳鉴定 具体实验结果分析
