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1、水凝胶在体外微环境中的三维模型肿瘤血管生成Hyun-Ho Greco Song, Kyung Min Park, Sharon Gerecht Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Johns Hopkins Physical Sciences Oncology Center and Institute for NanoBioTechnology, 3400 North Charles street, Baltimore,MD 21218, USA摘要 越来越多癌症治疗的临床试验失败证实需要升级当前的体外培养肿瘤细胞和肿瘤血管
2、生成模型。已经做了许多尝试利用水凝胶在体外培养的血管，但这些工具在体内模拟应用肿瘤血管生成仍然是新的。在这篇综述中，我们探讨了目前使用的水凝胶及其设计参数构造血管生成和评价癌症细胞和组织的血管生成的能力。通过这些水凝胶与其他技术，如印刷术和三维打印技术，可以创建一个先进的微血管模型作为微流体通道，以更准确地捕捉天然血管生成过程。1、前言尽管癌症死亡率总体呈下降趋势，但是在2013年超过1600000人在美国估测患上癌症，其中580000人估计死亡 1 。为了取代常规治疗，包括化疗和放疗，已经做了各种尝试来发现新的抗肿瘤活动药物。然而，临床试验是非常昂贵的，往往被高失败率拖慢，通常是由于被误导的
3、临床前模型。因此，更广泛的分析在临床前阶段是必需的，来更准确地预测临床试验的结果 2 。越来越多的研究人员现在正专注于靶向生物标志物来加快药品开发流程，最大限度地降低成本，并最大限度地从早期临床试验中获益 2,3 。特别是，血管生成一直是抗癌药物有吸引力的靶点 4 。由于未受管制的肿瘤生长，加剧氧气和营养剥夺，将肿瘤转变为血管生成表型，触发血管生长因子和细胞因子的释放，如血管内皮生长因子（VEGF）和白细胞介素-8（IL-8），对微环境5,6。这种失调的信号通路激活周边的内皮细胞（ECs）和血管周细胞，最终导致招募新血管到该区域以支持进一步肿瘤生长 6 。最终，这些血管将提供转移的手段 7 。
4、抑制这个血管生成过程一直是现代肿瘤研究的主要焦点之一，但许多最近的临床研究报告了各种各样的抗血管生成疗法，利用小分子抑制剂（如贝伐单抗，舒尼替尼，索拉非尼），包括高血压，伤口愈合，凝血，并在一些病例中，增加肿瘤活动和转移加速 8，12 。更重要的是，目前观察到的这一策略的优点是短暂性的，因为肿瘤是能够克服抗血管生成状态，通过采用不同的通路（例如，血管发生，血管拟态和血管共选择）来重塑自己的周边血管 6,1315 。更多的肿瘤血管生成的综合性研究和抗肿瘤血管生成的生物标志物的识别对发展可行的癌症治疗是至关重要的。然而，缺乏有能力的临床前模型往往阻碍成功的后续临床试验。动物体内移植瘤模型是通常使用
5、的，但往往不能足够地代表疾病，由于人类身体的不同。例如，肿瘤在小鼠异种移植模型的生长相对快于人类肿瘤，这导致了未成熟的血管不能与肿瘤生成血管相比较，肿瘤血管已经建立了较长一段时间16,17。此外，关键参数影响肿瘤进展，包括氧张力，营养梯度和机械力，不能很容易地控制和操纵在这些模型 9 。活体成像肿瘤血管一直特别具有挑战性，使其难以评估抗血管生成疗法的益处 15、18。为解决这些问题，研究人员已经开发各种替代体外模型用于癌细胞的生长和血管生成 1924 。为此一个模型的有效性取决于它是否可以紧密地模拟体内条件。到目前为止，大多数在体外癌症研究使用二维（2D）单层培养，细胞通常生长在塑料平面上 2
6、5 。然而，在肿瘤生长和血管生成中必不可少的细胞和细胞，细胞和细胞外基质（ECM）的相互作用不能概括在二维模型中，这些模型可能会产生误导性的结果，为将来的临床试验提供错误的指导。 事实上，越来越多的癌症研究现在利用三维（3D）培养模式，不足为奇的是，很多人都观察到显着不同的反应，相比于传统二维模型。由令人鼓舞的细胞与细胞和细胞与细胞外基质的相互作用，三维模型支持增加血管生长因子的释放，增加侵袭性和转移潜能，更慢的增殖，增加抗肿瘤药物和放射治疗的抵抗，以及生理基因表达谱，所有这些都是肿瘤细胞在体内的特征 24-32 。此外，整合素介导的细胞附着三维基质与通过基质金属蛋白酶（MMPs）细胞外基质（
7、ECM）的重塑对肿瘤细胞和内皮细胞（ECs）增殖和生存是关键的 27,33 。尤其是针对肿瘤血管生成，来自于肿瘤细胞的重塑的ECM和固定化分子支持内皮细胞招募和形态发生，导致组织周围的血管化 6,33 。这也表明内皮细胞对他们3D微环境的不同形貌，几何结构，和机械刚度的反应。在生理环境中，血管存在作为多蜂窝管与圆形截面的空心腔，在这其中内皮细胞极化，并与血管周边的ECM相互作用，以及受到来自于管腔内流体的剪切应力33,34。连同剪切应力，三维几何诱因有助于在血管内的内皮细胞的对齐和伸长，它直接与体内细胞功能和生存相关，它并不能观察到在一个静态的二维培养中 35-38 。此外，我们最近在体外证明
8、三维曲率，在这之上生长的内皮细胞能导致ECM沉积和组织化 39 。这些观察结果表明利用体内三维构建设计的优点在体外模拟各种组织的生理微环境。这些模型在组织工程领域中普遍存在，它允许研究人员设计系统来模仿各种组织类型的生理的细胞与细胞、细胞与细胞外基质间的相互作用 21,4042 。由于肿瘤血管发生在一个三维的生理环境，和其他组织一样，类似的工程原理和技术可以应用到模型中，用来研究癌症生物学。 水凝胶是亲水性聚合物网络结构，通常用于在体外创建组织的三维模型。水凝胶提供调整细胞微环境的机械强度和化学结构的手段。研究表明，不同的交联密度所产生的不同刚度的凝胶可以影响嵌入细胞的增殖、存活和迁移，提示干
9、细胞分化为特定的谱系 43-45 。此外，水凝胶可以进行化学修饰，呈现细胞附着点（如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，RGD）和基质金属蛋白酶降解的点，它们对于肿瘤进展，血管内皮细胞迁移是至关重要的，并最终，肿瘤血管生成 6,28,45,46 。最近，水凝胶已被纳入与其他技术如印刷技术，微织造，和微流控芯片技术来开发复杂的血管，从而有望实现更先进的和临床相关的肿瘤血管生成模型 47-49 。 三维模型在体外模型中的重要性日益明显，而且越来越多的研究受益于可调平台的水凝胶，它带给我们更多的控制组织的微环境。在这里，我们首先回顾了肿瘤血管生成的机制，并探讨天然和合成水凝胶和设计参数常规用于体外形成肿瘤和创
10、建血管。然后，我们研究目前正在进行的基于水凝胶的用于癌症研究的血管生成实验，以及探索新的、先进的体外模型，它们能概括从微血管网络到肿瘤血管生成。2、肿瘤血管生成机制 血管生成是一个复杂的过程，包括细胞-细胞外基质和细胞-细胞间的相互作用，不仅在内皮细胞之间，而且也在内皮细胞和其他类型细胞之间如壁细胞（周细胞和平滑肌细胞），成纤维细胞，和炎性细胞。它一直是过去几十年间癌症生物学的关键议题之一，由于它与肿瘤发展，维护和生存密切相关。癌症生长失控的本质关于肿瘤相关血管提供了独特的特点，它可能是癌症治疗的关键，应充分复制在体外模型，以获得更好的指导临床试验。在本节中，我们简要地描述了生物分子和肿瘤血管
11、生成的细胞机制。 最初，肿瘤生长可以使用从周围基质被动扩散来的氧气和营养物质，而不是从血管获得。然而，当肿瘤长到12 mm3，细胞的核心开始体验缺氧和营养匮乏和积累缺氧诱导因子（HIF）如HIF-1，它可以触发一个表型转换，被称为血管生成开关50，51。激活的途径导致细胞因子、生长因子和其他可溶性因子的过度表达，从而打破了促进-和抗血管生成因子的平衡。这种失控的级联反应最终招募新血管到肿瘤部位。广义概述肿瘤血管生成见图1。最为大家所知的肿瘤血管生成的信号转导途径涉及血管内皮生长因子（VEGF），血小板衍生生长因子（PDGF），成纤维细胞生长因子（FGF），和血管生成素（Ang），这是错综复杂的
12、协调和重叠。肿瘤血管生成始于周细胞活化，由肿瘤细胞分泌VEGF和Ang-2，导致细胞从血管脱离，以及获得更多的增殖表型 8,52 。在这些位置上的内皮细胞从而暴露于肿瘤细胞和激活的周细胞分泌的细胞因子和生长因子之中，同样地间质胶原丰富的ECM作为基底膜被降解 8,33,52 。在生理情况下，血管的通透性允许血浆蛋白泄漏到周围的基质，建立一个临时的基质（由来源于混合有先前存在的胶原蛋白的血浆中的纤维蛋白，玻连蛋白，纤连蛋白组成），在这之中新的血管可以发芽 33 。 血管出芽发生通过生物分子信号转导，细胞外基质重塑和细胞迁移的紧密结合实现的。从肿瘤细胞分泌的PDGF和VEGF招募周细胞到肿瘤，它可
13、以分泌膜基质金属蛋白酶和铺平内皮细胞血管出芽迁移的道路 53 。在芽尖的内皮细胞也表达mmpon theirmembranes（1型膜MMP）以帮助促进新血管结构的扩张 54 。在新芽的柄细胞中，血管内皮细胞酪氨酸磷酸化磷酸酶（VE-PTP）已经证明在内皮细胞分化中起着重要的作用，以及在内皮细胞连接中通过抑制VEGF受体-2参与管腔形成也起重要作用 55 。在某些类型的肿瘤，缺氧诱导的过度表达赖氨酰氧化酶（LOX），可以通过在肿瘤间质中交联的胶原纤维使ECM变得坚韧 54 。不同类型的肿瘤表达其他ECM重塑酶和不同类型MMPs，它能给肿瘤相关ECMs特征以从成分、取向、密度和机械性能等方面与正
14、常细胞外基质进行区分 56 。此外，在肿瘤间质中肿瘤相关成纤维细胞也被称为沉积的临时或肿瘤特异性细胞外基质 6 。这些不同的酶的重塑和切割加工ECM成活性片段如内皮抑素，肿瘤抑素，和血管能抑素，他们可以和其他可溶性因子合作来指导肿瘤血管生成 51,54 。 最近，有研究表明，肿瘤血管生成涉及不仅血管生成，而且也涉及血管发生，血管内皮祖细胞（EPCs）从骨髓中招募到血管部位 8 。事实上，克贝尔和他的同事们观察到显着的肿瘤生长抑制当使用抗血管生成治疗联合低剂量节律环磷酰胺，该药物可以抑制EPC活化 57 。EPC招募和活化机制还没有很好的建立，仍然有待解释，但一些研究表明，它是受VEGF,MMP
15、-9,HIF-1,FGF和IL-8等因子的调节 5860 。这个机制在Rafii和他的同事们的研究中 59 有更多细节。此外，癌症干细胞也可以分化为内皮细胞和周细胞支持肿瘤的血管，这在刘和欧阳的文章中有深入的探讨 61 。 在发展中的血管生成，最后阶段由新基底膜的形成与壁细胞附着于新形成血管组成，后者可以导致血管稳定和成熟 33 。相反，肿瘤驱动的血管生成缺乏这个阶段，因为肿瘤继续分泌缺氧和血管生成因子，因为它们需要越来越多的氧气和营养物质，以支持他们的无限、失控的增长。例如，虽然周细胞招募到肿瘤部位，但是他们不会适当地附加到新形成的血管以及不会促进基底膜的形成 52 。这些受损血管因此是多孔
16、的和漏的，造成不规则的血流量以及为肿瘤转移提供了一个平台 6 。图1，图像说明肿瘤血管生成。肿瘤细胞分泌的细胞因子和生长因子诱导分离的周细胞招募和内皮细胞活化，导致血管扩张和分支形成。肿瘤间质的细胞外基质是由肿瘤细胞分泌的酶对其进行重塑的，其富含胶原的基质与血浆蛋白结合，漏出来的生长的萌芽。图2，肿瘤微环境示意图，使用天然/合成水凝胶材料体外肿瘤模型。水凝胶材料的制造是通过生理条件下的一些物理/化学反应。这些亲水性网络提供三维微环境支持肿瘤的生长（如肿瘤形肽态发生，增殖，迁移以及肿瘤血管生成）通过控制无数的线索，如细胞粘附位点，蛋白水解降解，和基质刚度。图3，示意图显示体外血管生成模型，包括a.单层EC侵袭模型，b.主动脉环模型，c.生
