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1、菌种保藏和使用技术菌种保藏和使用技术 浙江省食品药品检验所浙江省食品药品检验所 王知坚王知坚 2 n n 菌种保藏和使用的有关概念菌种保藏和使用的有关概念 n n 菌种保藏和使用的有关法规菌种保藏和使用的有关法规 n n 我所现有菌种保藏管理规程我所现有菌种保藏管理规程 n n 基层单位可以使用的菌种保藏使用技术基层单位可以使用的菌种保藏使用技术 n n 有关菌种问题的答复有关菌种问题的答复 3 概念概念 n n 标准菌株：由国内或国际菌种保藏机构保藏的，标准菌株：由国内或国际菌种保藏机构保藏的， 遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌株。遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌株。 n n 标准储
2、备菌株：由标准菌株经一次传代得到的培标准储备菌株：由标准菌株经一次传代得到的培 养物。养物。 n n 商业派生菌株：由供应商提供的所有特性与标准商业派生菌株：由供应商提供的所有特性与标准 菌株等效的菌株。菌株等效的菌株。 n n 代：将活的微生物接种到新鲜培养基中进行培养代：将活的微生物接种到新鲜培养基中进行培养 ，并希望获取新的微生物培养物。这种操作方式，并希望获取新的微生物培养物。这种操作方式 ，新培养物对接种培养物而言就称为一代。，新培养物对接种培养物而言就称为一代。 n n 工作菌株：由标准储备菌株经传代得到的培养物工作菌株：由标准储备菌株经传代得到的培养物 。 4 中国医学菌种保藏中
3、心提供的标准菌株 5 美国国家菌种保藏中心提供的标准菌株 6 法国生物梅里埃公司提供的商业派生菌株（Bioball) 7 我所现在保藏的标准储备菌株 8 我所以往保藏的标准储备菌株 9 我所制备的工作菌株 10 法规法规 n n 中国药典中国药典20052005年版年版 n n 中国药典中国药典20102010年版年版 n n 实验室认可准则实验室认可准则 n n 其他行业标准其他行业标准 11 n n 中国药典中国药典20052005年版年版 n n 无菌检查法：灵敏度检查项下无菌检查法：灵敏度检查项下 菌种菌种 培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数 不得超过
4、不得超过5 5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥 菌种为第菌种为第0 0代），并采用适宜的菌种保藏技术，代），并采用适宜的菌种保藏技术， 以保证试验菌株的生物学特性。以保证试验菌株的生物学特性。 n n 微生物限度检查法：细菌、霉菌及酵母菌计数微生物限度检查法：细菌、霉菌及酵母菌计数 项下项下 菌种菌种 同无菌检查法同无菌检查法 12 n n 中国药典中国药典20102010年版年版 n n 在方法的附录中对菌种的规定同在方法的附录中对菌种的规定同20052005年版年版 n n 在新增的在新增的“ “药品微生物实验室规范指导原则药品微生物实验室规范指导原则” ”
5、中对菌种有中对菌种有 了较为明确的规定了较为明确的规定 n n 允许使用标准菌株和商业派生菌株允许使用标准菌株和商业派生菌株 n n 标准菌株应按保藏机构提供的说明进行复活标准菌株应按保藏机构提供的说明进行复活 n n 标准储备菌株应进行纯度和特性确认标准储备菌株应进行纯度和特性确认 n n 标准储备菌株建议采用低温冷冻干燥、液氮贮存或超低温冷冻标准储备菌株建议采用低温冷冻干燥、液氮贮存或超低温冷冻 保藏的方法保藏的方法 n n 标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株 n n 冷冻菌株解冻后不得重新冷冻和再次使用冷冻菌株解冻后不得重
6、新冷冻和再次使用 n n 工作菌株不可替代标准菌株，商业派生菌株仅可用作工作菌株工作菌株不可替代标准菌株，商业派生菌株仅可用作工作菌株 13 n n 实验室认可准则实验室认可准则 n n 检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测 领域的应用说明（领域的应用说明（CNAS-CL09CNAS-CL09） n n 实验室必须保存有满足试验需要的标准菌种或参照实验室必须保存有满足试验需要的标准菌种或参照 标本标本 n标准菌种或标本必须从认可的菌种或标本收集途径 获得。实验室必须建立和保存其所有菌种、标本的 收集、贮藏、保存、确认试验的记录 n实验室应有文件化的程
7、序管理参照菌种（从原始菌 种到日常工作用菌）。该程序应包括： n参照菌种必须定期转种传代，并做确认试验，包括实验室 中所需要的关键诊断指标，实验室必须加以记录并予以保 存 14 n每一支参照菌种都应以适当的标签、标记或其它标识方式 来表示其名称、标准号、接种日期和所传代数 n其管理记录中还应包括（但不限于）以下内容： n从原始菌种传代到工作用菌种的代数； n菌种生长的培养基及孵育条件； n菌种生存条件。 15 n n 其他行业标准其他行业标准 n n 实验室质量控制规范食品微生物检测（实验室质量控制规范食品微生物检测（GB/T 27405-GB/T 27405- 20082008） n n 实
8、验室应制订并实施特定程序管理和使用标准培养物实验室应制订并实施特定程序管理和使用标准培养物 n n 实验室应通过标准培养物来验收培养基、验证方法和评估实验实验室应通过标准培养物来验收培养基、验证方法和评估实验 操作操作 n n 实验室可使用来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株实验室可使用来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株 ，或使用与标准菌株所有特性等效的商业派生菌株，或使用与标准菌株所有特性等效的商业派生菌株 n n 标准菌株传代培养一次，制得标准储备菌株，同时应进行确认标准菌株传代培养一次，制得标准储备菌株，同时应进行确认 试验。建议使用深度冰冻或冻干的方法制备标准储备菌株。试
9、验。建议使用深度冰冻或冻干的方法制备标准储备菌株。 n n 标准储备菌株经继代培养获得工作菌株。一旦标准储备菌株被标准储备菌株经继代培养获得工作菌株。一旦标准储备菌株被 解冻，最好不要重新冷冻和再次使用。解冻，最好不要重新冷冻和再次使用。 n n 工作菌株不可替代标准菌株。标准菌株的商业派生菌株仅可用工作菌株不可替代标准菌株。标准菌株的商业派生菌株仅可用 作工作菌株。作工作菌株。 n n 标准菌株发生变化经验证不符合规定应及时销毁。标准菌株发生变化经验证不符合规定应及时销毁。 16 我所的菌种管理规程我所的菌种管理规程 n n 菌种的采购菌种的采购 n n 菌种的复苏菌种的复苏 n n 菌种的
10、传代菌种的传代 n n 菌种的保藏菌种的保藏 n n 菌种的使用和销毁菌种的使用和销毁 17 n n 菌种的采购菌种的采购 n n 每年年底，由实验室菌种管理人员提出下一年每年年底，由实验室菌种管理人员提出下一年 度菌种采购的计划，计划购置的菌种一般为药度菌种采购的计划，计划购置的菌种一般为药 典收载的标准菌种，填写请购单，经批准后，典收载的标准菌种，填写请购单，经批准后， 由所采购部门向指定的菌种保藏机构购置。由所采购部门向指定的菌种保藏机构购置。 n n 所购菌种均为冷冻干燥菌种。所购菌种均为冷冻干燥菌种。 n n 采购部门购入菌种后，应及时移交实验室。实采购部门购入菌种后，应及时移交实验
11、室。实 验室菌种管理人员应仔细核对菌种发放单和冷验室菌种管理人员应仔细核对菌种发放单和冷 冻干燥菌种管标签等各项信息，确认无误后，冻干燥菌种管标签等各项信息，确认无误后， 置置4 46 6暂存。暂存。 18 n n 菌种的复苏菌种的复苏 n n 菌种在打开前应仔细核对标签上菌名、菌号。菌种在打开前应仔细核对标签上菌名、菌号。 并注意一株菌种使用一套打开用具，严防交叉并注意一株菌种使用一套打开用具，严防交叉 污染。污染。 n n 菌种复苏应在生物安全柜内操作。菌种复苏应在生物安全柜内操作。 n n 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 、沙门菌、生孢梭
12、菌和白色念珠菌可同时接种、沙门菌、生孢梭菌和白色念珠菌可同时接种 液体培养基和琼脂培养基斜面，枯草芽孢杆菌液体培养基和琼脂培养基斜面，枯草芽孢杆菌 、短小芽孢杆菌、藤黄微球菌和黑曲霉可接种、短小芽孢杆菌、藤黄微球菌和黑曲霉可接种 琼脂培养基斜面。琼脂培养基斜面。 n n 取琼脂培养基斜面上的菌苔按要求对菌种的纯取琼脂培养基斜面上的菌苔按要求对菌种的纯 度进行鉴定。度进行鉴定。 19 n n 菌种的传代菌种的传代 n n 应在生物安全柜中进行菌种的传代应在生物安全柜中进行菌种的传代 。 n n 取经过纯度鉴定的第取经过纯度鉴定的第1 1代菌种管（琼脂培养基斜代菌种管（琼脂培养基斜 面培养物）用于
13、传代制备第面培养物）用于传代制备第2 2代菌种。代菌种。 n n 接种完毕，液体培养基或琼脂培养基斜面应在接种完毕，液体培养基或琼脂培养基斜面应在 规定的温度下培养适宜的时间，芽孢杆菌宜培规定的温度下培养适宜的时间，芽孢杆菌宜培 养养5 56 6天，黑曲霉宜培养天，黑曲霉宜培养5 57 7天，其他菌种一天，其他菌种一 般培养般培养18182424小时。小时。 20 n n 菌种的保藏菌种的保藏 n n 保存的容器为无菌冻存管，保藏温度为保存的容器为无菌冻存管，保藏温度为-70-70。 n n 在冷冻前，应贴上菌种标签。标签内容应包括在冷冻前，应贴上菌种标签。标签内容应包括 菌名、菌号、传代日期
14、和有效期。菌名、菌号、传代日期和有效期。 n n 所有冻存管应立即置低温冰箱中，迅速冷冻。所有冻存管应立即置低温冰箱中，迅速冷冻。 n n 该方法保藏菌种的有效期规定为该方法保藏菌种的有效期规定为6 6个月个月 。 21 n n 菌种的使用和销毁菌种的使用和销毁 n n 本所保藏的菌种主要供本所检验工作使用并可对外提本所保藏的菌种主要供本所检验工作使用并可对外提 供给有关涉药单位。本所提供的菌种为第二代低温冷供给有关涉药单位。本所提供的菌种为第二代低温冷 冻菌种。冻菌种。 n n 本所检验工作所需菌种，领用人应向菌种管理人员领本所检验工作所需菌种，领用人应向菌种管理人员领 取，并在取，并在菌种
15、领用记录菌种领用记录上记录菌名、数量、领用上记录菌名、数量、领用 人等信息。人等信息。 n n 外单位向我所购买菌种，应凭单位介绍信，并注明菌外单位向我所购买菌种，应凭单位介绍信，并注明菌 名、菌号、数量，必要时可预约购买。名、菌号、数量，必要时可预约购买。 n n 本所保藏的菌种，一般应每年更换原种（每年打开一本所保藏的菌种，一般应每年更换原种（每年打开一 套冷冻干燥菌种传代制备第套冷冻干燥菌种传代制备第1 1代原种保存）。代原种保存）。 n n 过期菌种应及时销毁，销毁时应经过期菌种应及时销毁，销毁时应经121121 20 20分钟的生物分钟的生物 灭活处理。灭活处理。 22 n n 我所
16、对外提供菌种时所附的菌种使用说明我所对外提供菌种时所附的菌种使用说明 和发放证明和发放证明 菌种证明（菌种证明（20092009年版）年版）.doc.doc 23 基层单位可使用的技术基层单位可使用的技术 n n 通过制备工作菌种进行菌种保藏的方法通过制备工作菌种进行菌种保藏的方法 n n 通过制备标准储备菌种进行菌种保藏的方通过制备标准储备菌种进行菌种保藏的方 法法 24 n n 通过制备工作菌种进行菌种保藏的方法通过制备工作菌种进行菌种保藏的方法 n n 从我所采购超低温冷冻的标准储备菌株（第二代）从我所采购超低温冷冻的标准储备菌株（第二代） n n 将所购菌株置将所购菌株置4 46 6暂存，并尽快制备工作菌种暂存，并尽快制备工作菌种 n n 准备足够数量的琼脂斜面培养基准备足够数量的琼脂斜面培养基 n n 在生物安全柜内取标准储备菌株在生物安全柜内取标准储备菌株1 1接种环，划线接种至接种环，划线接种至 斜面上，重复操作直至所有斜面均被接种斜面上，重复操作直至所有斜面均被接种 n n 将所
