半枝莲黄酮剖析

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1、结合半枝莲浅谈黄酮类化合物的提取、 分离纯化和含量测定 刘勇 主要内容： 一、黄酮类化合物的简述 二、黄酮类化合物的提取 三、黄酮类化合物的分离和纯化 四、黄酮类化合物的含量测定 五、参考文献 一、黄酮类化合物的简述 黄酮类化合物是以2-苯基色原酮为基本母核的一类化 合物，具有C6-C3-C6基本碳架的。天然黄酮类化合物分为黄 酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮、二氢异黄 酮、查耳酮、二氢查耳酮、花色素、黄烷醇、橙酮、双苯 吡酮等。1 黄酮类化合物分布广泛，多存在于高等植物中，如唇 形科、玄参科、蔷薇科、芸香科、菊科等。2 半枝莲为唇 形科植物，含有的黄酮类成分大体分为黄酮，二氢黄酮和

2、黄酮苷三种。目前从半枝莲中分离并确定结构的黄酮类成 分有50种，其中黄酮占28种，二氢黄酮占6种，黄酮苷占16 种。3 据文献报道，不同地区的半枝莲总黄酮平均含量为 2.31%。4 黄酮类化合物具有抗氧化及清除自由基作用 ，抗癌、抗肿瘤作用，抗菌、抗病毒作用，抗衰 老及DNA保护功能，抗心脑血管疾病的作用，调 节内分泌系统的作用，抗炎、镇痛作用等。5 其 中，具有抗癌作用的成分是我们课题研究的重 点。 焦燕6对半枝莲分离纯化得到了野黄芩素、 木樨草素、芹菜素和4-羟基汉黄芩素，并通过 MTT活性实验，发现四种化合物对Hela细胞有一 定的抑制作用。 二、黄酮类化合物的提取 主要提取方法： 1.

3、溶剂提取 1.1水提取 1.2碱性水或碱性稀醇提取法 1.3有机溶剂提取 2.超声提取法 3.微波提取法 4.酶解法 5.半仿生提取方法 6.超临界流体萃取法 1.溶剂提取 1.1水提取 黄酮类化合物的水提取法是一种较传统的方 法，主要用于黄酮苷类的提取。因提取率低, 提 取物中杂质较多( 如无机盐、蛋白质、糖类等),后 续分离麻烦, 现在很少单独使用该方法。 1.2碱性水或碱性稀醇提取法 黄酮类化合物大多具有酚羟基, 易溶于碱水, 酸化后又可沉淀析出。因此可用碱性水(碳酸钠、 氢氧化钠、氢氧化钙水溶液) 或碱性稀醇(50%乙 醇)浸出, 浸出液经酸化后析出黄酮类化合物。7 1.3有机溶剂提取

4、 常用的有机溶剂有甲醇、乙醇等, 一般采取乙 醇为提取溶剂。高浓度的乙醇(如90% -95%) 适于 提取苷元, 浓度 60 % 左右的乙醇适于提取苷类。 提取次数一般为 2-4 次, 提取方法有热回流提取和 冷浸提取两种方式。 8 邸多隆等9 用正交实验法优选半枝莲提取工 艺,以浸膏得率、总黄酮和野黄芩苷提取率为评价 指标,选择乙醇浓度(%)、加醇量(倍)、提取时间(h) 为考察因素,利用正交试验确定了醇提取半枝莲的 最佳工艺条件为75%乙醇10倍量提取2.0h,共提取2 次,平均乙醇浸膏得率为13.6%,总黄酮和野黄芩苷 提取率分别为91.7%和78.4%。 2.超声提取法 原理是利用超声

5、波在液体中的空化作用加速 植物有效成分的浸出。 10 陈莉华等11 通过单因素和正交试验获得超声 波辅助乙醇提取半枝莲黄酮的最佳工艺条件是乙 醇体积分数为50%，料液比1:30( g/mL)，超声提 取时间25min，浸泡温度65，此时黄酮的得率 为3.0%。 3.微波提取法 原理是利用磁控管所产生的超高频率的快速 震动, 使材料内分子间相互碰撞、挤压, 利于有效 成分的浸出。7 薛梅等12从半枝莲运用微波技术提取半枝莲 总黄酮,反应速度加快,提高了提取效率,测得半枝 莲中总黄酮含量为3.74%。 4. 酶解法 原理是通过酶的作用裂解植物细胞壁, 使得 植物次生代谢产物充分得到释放, 从而提高

6、药用 成分得率一种分离提取方法。13 庞允14 在研究银杏叶中黄酮的提取工艺时 发现，酶解法同乙醇提取法相比,黄酮的提取率 由1.29%提高为1.78%。 5. 半仿生提取方法 半仿生提取法，是从生物药剂角度，模仿药 物在肠胃转运过程所经历的环境，模拟pH溶液依 次提取，从而得到含黄酮成分的混合物。 15 陈丛瑾等 16利用半仿生提取法分别以pH 2盐 酸溶液和pH 7.5、 pH 8.5 的氯化铵- 氨水的缓冲溶 液作为提取液提取香椿叶中的总黄酮,提取量为 10.3417 mg / g。 6. 超临界流体萃取法 超临界流体萃取是利用超临界流体的特殊性 能进行萃取的一种高效提取分离技术。与传统

7、的 中药有效成分的提取技术相比,超临界流体萃取技 术具有许多独特的优点,因而成为中药现代化的关 键技术之一。 孙婷17用超临界CO2法萃取银杏叶黄酮：萃 取压力20 MPa，萃取罐的温度40 ，夹带剂流量 14 mL/min，萃取2 h，得总黄酮的含量为29.1 % 。 三、黄酮类化合物的分离和纯化 主要的分离纯化手段： 1.硅胶柱色谱法 2.聚酰胺柱色谱法 3. 凝胶柱色谱法 4. 大孔树脂吸附法 5.高速逆流色谱技术 6.高效制备液相色谱技术 1.硅胶柱色谱法 此法应用范围最广，不仅可以分离黄酮苷, 还 可以分离各种苷元。分离苷元时常用氯仿-甲醇混 合溶剂作洗脱剂，分离苷类时,可用氯仿-甲

8、醇-水 或乙酸乙酯-丙酮-水作为洗脱剂。18 王文蜀等19 通过硅胶柱色谱，并运用硅胶薄 层制备以及凝胶柱色谱的方法分离纯化半枝莲中 黄酮类化合物，得到了5个黄酮类化合物。 2.聚酰胺柱色谱法 聚酰胺是通过分子中的酰胺基与黄酮类化合物 分子上的羟基形成氢键缔合而产生吸附作用。 此法对各种黄酮类化合物都有较好的分离效 果, 其层析容量较大,适合制备性分离, 洗脱剂常用 水-甲醇, 水-乙醇或者甲醇-氯仿。18 肖海涛通过硅胶柱色谱和聚酰胺柱色谱在半枝 莲正丁醇部位分离得到了木犀草素。20 3. 凝胶柱色谱法 主要有两种型号的凝胶: Sephadex G 和 Sephadex LH-20。凝胶是具

9、有多孔性网状结构 的高分子化合物, 对黄酮类化合物的吸附程度 取决于分子的大小和游离羟基的数量。 分离游离黄酮时, 主要靠吸附作用, 凝胶对 黄酮类化合物的吸附程度取决于游离羟基的数 目; 但分离黄酮苷时, 则分子筛的性质起主导作 用。21 李萍通过硅胶柱色谱和Sephadex LH-20 柱色谱在半枝莲正丁醇部位分离得到了4一羟 基汉黄芩素。22 4. 大孔树脂吸附法 大孔吸附树脂是不含交换基团，具有大孔结 构的有机高聚物吸附剂，一般为白色球形颗粒。 具有吸附和分子筛的双重作用，有机化合物可根 据吸附力及相对分子质量大小的不同，被大孔树 脂吸附后再经一定溶剂洗脱而被分离。23 王英峰等24采

10、用醇提法提取半枝莲中的黄酮 成分,利用大孔树脂法分离纯化,并运用液相色谱- 质谱联用法(LC-MS)进行检测，结果显示半枝莲黄 酮成分主要存在于20%乙醇洗脱部分和40%乙醇洗 脱部分。 5.高速逆流色谱技术 HSCCC的原理是利用两相溶剂体系在高速旋 转的螺旋管内建立起一 种特殊的单向性流体动力 学平衡,当其中一相作为固定相,另一相作为流动 相,在连续洗脱的过程中能保留大量的固定相,物质 的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现。8 比较适用于分离黄酮类化合物的溶剂系统是 氯仿-正丁醇-甲醇-水（10:1:10:6），它既用于苷 元的分离，也可用于苷的分离。10 6.高效制备液相色谱技术 高

11、效制备液相色谱分离非常迅速, 是制备和纯 化黄酮类化合物非常好的手段。 何枢衡等25应用大孔树脂、正相硅胶、反相 ODS、Sephadex LH-20以及制备型高效液相等色 谱法对半枝莲的化学成分进行分离鉴定了8个黄酮 类化合物。 四、黄酮类化合物的含量测定 常用测定方法： 1.比色法 2.紫外分光光度法 3.薄层扫描法 4.高效液相色谱法 1.比色法 原理是利用黄酮类化合物结构上的酚羟基特 征及其还原性进行显色，有邻二羟基或3、5位有 羟基取代的黄酮可与金属离子形成黄色或橙色的 络合物，这些络合物在特定波长有最大吸收，可 由此用比色法进行定量。 常用硝酸铝亚硝酸钠溶液做为显色剂，与 黄酮类化

12、合物生成铝络合物，在500 nm处有最大 吸收。常测定的是总黄酮的量。10 2010版药典中槐花中芦丁的含量测定： 对照品溶液的制备 取芦丁对照品50 mg，精密称定，置25 ml 量瓶中，加甲醇适量，置水浴上微热使溶解，放冷，加甲醇至 刻度，摇匀。精密量取10 ml, 置 100 ml 量瓶中，加水至刻度， 摇匀，即得（每l ml 中含芦丁0. 2 mg)。 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液l ml 、 2 ml 、 3 ml 、 4 ml、5 ml与6 ml,分别置25 ml量瓶中，各加水至6. 0 ml，加5% 亚硝酸钠溶液 l ml，混匀，放置6分钟，加10%硝酸铝溶液l ml ，摇

13、匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10 ml ，再加水至刻度， 摇匀，放置15分钟，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光 度法（附录VA)，在500 nm 波长处测定吸光度，以吸光度为纵 坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。 测定法 取本品粗粉约l g，精密称定，置索氏提取器中，加 乙醚适量，加热回流至提取液无色，放冷，弃去乙醚液。再加 甲醇90 ml，加热回流至提取液无色，转移至100 ml量瓶中，用 甲醇少量洗涤容器，洗液并人同一量瓶中，加甲醇至刻度，摇 匀。精密量取10 ml，置100 ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。精 密量取3 ml, 置25 ml 量瓶中，照标准曲线制备项下的方法， 自“

14、 加水至6. 0 ml“起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品 溶液中含芦丁的重量（g）, 计算，即得。 本品按干燥品计算，含总黄酮以芦丁（C27H30Ol6）计，槐花不 得少于8.0%；槐米不得少于20. 0%。 2.紫外分光光度法 黄酮类化合物均含有-苯基色原酮基本结构 ，羰基与2个芳香环形成2个较强的共轭系统，对 紫外光相应有两个区域特征吸收，最大吸收波长 范围随各化合物不同而异。可根据最大吸收波长 直接用紫外分光光度法测定植物中黄酮类化合物 的含量。10 李洁采用紫外分光光度法对不同采收期的半 枝莲中总黄酮含量进行测定，发现不同采收期半 枝莲中总黄酮的含量差异明显，其中以7月采收的

15、 半枝莲中总黄酮含量最高。26 3.薄层扫描法 薄层扫描法是样品经薄层层析分离后,直接在薄层 扫描仪上，选用单波长或双波长法扫描，得薄层斑点 的面积积分值，由回归方程计算含量。该法不受其他 成分干扰，方法简便、准确。7 章崇仪等27用聚酰胺薄膜为固定相，以乙醇-36% 醋酸为展开剂展开后，双波长反射法锯齿扫描测定了 黄芩中黄芩苷的含量。 4.高效液相色谱法 乔春峰等28用Agilent 1100高效液相色谱仪测 定半枝莲药材中野黄芩苷、野黄芩素、木犀草素 和芹菜素含量。 结果见下表： 焦燕等29采用液相色谱-二级质谱联用法( -/)对不同产地半枝莲药材中的野黄芩 苷和芹菜素进行含量测定。 结果

16、：所测12个产地半枝莲中,野黄芩苷和芹 菜素的含量范围分别为0.03%0.39%和0.02% 0.30%。 五、参考文献 1 刘斌. 黄酮类化合物- -中药化学(十四)J. 中国中医药报, 2004,(2132). 2 匡海学. 中药化学M. 北京:中国中医药出版社,2003,1:133. 3 李园园.半枝莲 Scutellaria barbata D.Don 成分及生物活性研究D.青岛: 中国海洋大学,2012. 4 李守拙,潘海峰. 半枝莲药材中总黄酮含量测定J. 承德医学院学报, 2001, 18(1): 33 - 35. 5 王倩,常丽新,唐红梅. 黄酮类化合物的提取分离及其生物活性研究进 展J. 河北理工大学学报,2011,33(1):113-114. 6 焦燕. 半枝莲中黄酮类成分的研究D. 北京:首都师范大