无菌检查法概念

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1、无菌检查法概念 指用于检查药典要求无菌的药品、医疗 器具、原料、辅料及其他品种是否无菌 的一种方法。 若供试品符合无菌检查法的规定，仅表 明了供试品在该检验条件下未发现被微 生物污染。 无菌检查法概念 无菌检查是通过目检微生物在培养基中 的生长来判断结果。 无菌检验只能给出该批产品受污染的程 度。 无菌检验合格只能说明被测样品无菌， 不能证明整批样品无菌。 无菌检查的设施、环境、人员 检查环境应在洁净度10000级下的局部洁 净度100级的单项流空气区域内或隔离系 统中进行，其全过程必须严格遵守无菌 操作。 隔离系统按相关的要求进行验证，其内 部环境的洁净度须符合无菌检查的要求 。 无菌检查的

2、设施、环境、人员 规定应定期按医药工业洁净室（区） 悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法 的现行国家标准进行洁净度的验证。 日常检验还需对试验环境进行监控。 无菌检查的设施、环境、人员 无菌检查人员必须具备微生物专业知识 ，并经过无菌技术的培训。 无菌隔离系统 无菌隔离系统是一个不受外界环境影响的、可进行无菌操作的独 立环境系统。 使用隔离系统的优点：它能创造一个持续高效的高度无菌空间,保 护产品免受外源性污染，包括操作人员、操作环境及外包装等的 污染，确保操作环境及实验物品表面能达到无菌要求，防止出现 假阳性结果,保证无菌实验结果的可靠性，从而实现一次检出的要 求；保护操作人员免受实验过程中的

3、有害物质带来的污染；放置 隔离器的环境洁净度不需要特殊要求，移动方便等优点 。 HTY无菌隔离系统 无菌检查用培养基的种类及用途 硫乙醇酸盐流体培养基-培养好氧菌、 厌氧菌 改良马丁培养基-培养真菌及好氧细菌 选择性培养基-按硫乙醇酸盐流体培养 基或改良马丁培养基的处方及制法，在 培养基灭菌或使用前加入适量的中和剂 或表面活性剂。 培养基的制备及装量 培养基可按处方制备，亦可使用按该处方生产 的符合规定的脱水培养基。 硫乙醇酸盐流体培养基的装量与容器高度的比 例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色） 不超过培养基深度1/2。供试品接种前，培养 基氧化层颜色不得超过培养基深度的1/5，否 则，须

4、经100水浴加热至粉红色消失（不超 过20分钟），迅速冷却，只限加热一次。 培养基的储存 制备好的培养基应该保存在2-25、避光的 环境，若保存于非密闭容器中，一般在3周 内使用；若保存于密闭容器中，一般可在1 年内使用。 应结合实际情况进行验证，以确定培养基 有效期。 培养基的适用性检查 本检查可在供试品的无菌检查前或与供 试品的无菌检查同时进行。 无菌性检查 重要性：培养基无菌不合格将导致实验 的假阳性结果。 检查：每批培养基随机抽取不少于5支或 5瓶，硫乙醇酸盐流体培养基置30-35 培养，改良马丁培养基置23-28培养， 培养14天，应无菌生长。 培养基的适用性检查 灵敏度检查 菌种

5、硫乙醇酸盐流体培养基 金黄色葡萄球菌 生孢梭菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 改良马丁培养基 白色念珠菌 黑曲霉 培养基的适用性检查 菌种选择的原则 代表性、普遍性、易存活、低或非致病性、标准菌株( 或该药品中常见的污染菌)。 金黄色葡萄球菌（代表革兰氏阳性菌）、铜绿色假单 胞菌（代表革兰氏阴性菌）、枯草芽孢杆菌（代表药 品中最常见或最易污染的菌）、生孢梭菌（代表厌氧 菌）、白色念珠菌（代表酵母菌）、黑曲霉（代表霉 菌）。 菌种的要求：不得超过5代。采用适宜的菌种保藏方法 保存，以保证菌种的生物学特性。 加菌量:100cfu。 培养基的适用性检查 菌液制备 试验菌 培养基 培养温度 培养时间 金

6、黄色葡萄球菌 营养肉汤 30-35 18-24 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 生孢梭菌 硫乙醇酸盐流体 白色念珠球菌 改良马丁培养基 23-28 24-48 黑曲霉 改良马丁琼脂斜面 5-7天 培养基的适用性检查 培养基接种 试验菌 培养基 每管装量 接种管数 接种量 培养时间 金黄色葡萄球菌 硫乙醇酸盐 12 ml 2 支 1 ml 3天 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 生孢梭菌 白色念珠球菌 改良马丁培养基 9 ml 2支 1 ml 5天 黑曲霉 其中硫乙醇酸盐及改良马丁培养基均有 1支不接种作为空白 接种量 100cfu（不能多） 培养基的适用性检查 结果判断 空白对照应无菌生长，若加菌的培

7、养基管均生长良好，判该培养基的 灵敏度检查符合规定。 试验同时应做空白对照 培养基说明 无菌检验培养基所能支持生长的微生物 是有限的。 微生物种类繁多，这些微生物有广泛的 生长要求，如：营养、温度和氧等。 无菌检验培养基不可能支持所有微生物 的生长，选择了支持那些最有可能污染 药品和在药品中生长的微生物的营养的 培养基。 供试品的无菌检查法 无菌检查法包括直接接种法和薄膜过滤法。只 要供试品性状允许，应优先采用薄膜过滤法。 进行供试品无菌检查时，所采用的检查方法和 检验条件应与验证的方法相同。 薄膜过滤法可以提高无菌检验的检出率，特别 是抑菌性供试品，采用薄膜过滤法可以有效消 除供试品的抑菌性

8、，提高检出率。 供试品的无菌检查法-直接接种法 样品直接移入无菌培养基中。 每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品 体积不得大于培养基体积的10%。 同时硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于 15ml，改良马丁培养基每管装量不少于10ml。 培养基的用量和高度同方法验证试验。 每种培养基接种的管数同供试品的检验数量。 供试品的无菌检查法-薄膜过滤法 原理：薄膜过滤法是将供试品通过滤膜，微生物截留 于滤膜上，若有抑菌作用的药品同时使用冲洗液冲洗 滤膜上残留的供试品（如有残留会抑制微生物生长） ，然后，培养滤膜看其是否有微生物生长。 选择滤膜材质时应考虑供试品及其溶剂的特性，水溶 性供试液过滤前先

9、将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。 油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。 使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。 供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每 张滤膜每次冲洗量为100ml，且冲洗量不超过1000ml， 以避免滤膜上的微生物受损伤。 过滤器应优先选择封闭式薄膜过滤），也可使用一般 薄膜过滤器。滤膜孔径不大于0.45m，直径约为50mm 。 供试品的无菌检查法 检验数量 指一次检验所用供试品最小包装容器的数 量 采用薄膜过滤法应增加1/2的最小检验数量作为阳性对 照；采用直接接种法应增加供试品无菌检查时每个培 养基容器接种的样品量作为阳性对照。 检验量 指一次试验所用供试

10、品总量（g或ml），若 每支（瓶）供试品装量按规定足够接种两份培养基， 则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养 基。采用薄膜过滤法时，检验量不应少于直接接种法 的供试品总量，只要供试品的特性允许，应将所有容 器内的全部内容物过滤. 无菌检查的稀释液、冲洗液 无菌检验所用稀释液、冲洗液种类应对微生物无毒、 无抑制作用。稀释液用量、冲洗液冲洗次数及用量等 应当与验证合格的方法一致。每张滤膜每次冲洗量为 100ml，总冲洗量不宜过大（不超过1000ml），用量过 多不仅容易破坏滤膜上截留的微生物，而且对滤膜造 成损伤；但也不能太少，否则不能将供试品冲洗干净 ，无法消除抑菌性。 0.1%蛋白胨

11、水溶液 PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 如需要可加入表面活性剂或中和剂,应经方法验证证明 其有效性，并对细菌存活无影响。 供试品溶液的制备 水溶液供试品 取规定量，直接过滤，或混合至含适量稀释液的 无菌容器内，混匀，立即过滤。 如供试品具有抑菌作用或含防腐剂，须用适量的 冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数不得少于三次。 冲洗后，如用封闭式薄膜过滤器，分别将100ml硫 乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基加入相应 的滤筒内。 如果采用一般薄膜过滤器，取出滤膜，将其剪成3 等份，分别置于含50ml硫乙醇酸盐流体培养基及 改良马丁培养基容器中，其中一份做阳性对照用 。 可溶于水的固体制剂供试品 取规定量，加适

12、宜的稀释液溶解或按标签说明复 溶，然后照水溶液供试品项下的方法操作。 -内酰胺类抗生素供试品 取规定量，按水溶液或固体制剂供试品的处理法 处理，过滤，用适宜的冲洗液冲洗滤膜。再用含 适量-内酰胺酶的冲洗液清除残留在滤筒、滤膜 上的抗生素后接种培养基，必要时培养基中可加 少量的-内酰胺酶；或将滤膜直接接入含适量 -内酰胺酶的培养基中。接种培养基的方法照水溶 液供试品项下的方法操作。 供试品溶液的制备 非水溶性制剂供试品 取规定量，直接过滤或混合溶于含聚山梨酯80或 其它适宜乳化剂的稀释液中，充分混合，立即过 滤。用含0.1%-1%聚山梨酯80的冲洗液冲洗滤膜至 少3次。滤膜于含或不含聚山梨酯80

13、的培养基中培 养。培养基接种照水溶液供试品项下的方法操作 。 其他类供试品： 可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和粘性油剂供试 品 无菌气（喷）雾剂供试品 装有药物的注射器供试品 具有导管的医疗器具(输血、输液袋等)供试品 供试品溶液的制备 阳性对照试验 目的：验证供试品经灭活后或用其它方式（稀 释、冲洗等）处理后是否仍有抑菌或杀菌的作用 ，确保检验条件符合要求，防止出现假阴性。 培养条件是否符合要求。 应根据供试品的特性选择阳性对照菌。 无抑菌及抗革兰阳性-金黄色葡萄球菌 抗革兰阴性-大肠埃希菌 抗厌氧菌-生孢梭菌 抗真菌-白色念珠菌 阳性对照菌加量：100cfu 阳性对照培养48-72h 应生长良

14、好。 阴性对照 不加样品的无菌检验 目的：确认无菌检验所用的稀释液、冲洗液、培 养基、青霉素酶、集菌器等物品及人员操作、检 验环境、仪器设备等是否有菌存在。 应取相应溶剂和稀释剂同法操作。 应与无菌检验同时做。 阴性对照不得有菌生长。 培养及观察 供试品无菌检查培养温度和时间非常重要，只 有在合适的温度和时间内微生物才能生长良好 。 培养14天，如果培养基浑浊或培养14天后从外 观不能判断是否长菌，可取该培养液适量转种 至同种培养基或划线接种于斜面培养基上，培 养细菌2天、真菌3天，观察有无菌生长，或镜 检进行判断。 结果判断 前提:阳性对照为阳性，阴性对照为阴性，无菌 检验方有效。 若供试品

15、管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌 生长，判供试品符合规定。 若供试品中任何1管显混浊并确证有菌生长， 判供试品不符合规定。 除非能充分证明，生长的微生物非供试品所含 。 当符合下列至少一个条件时，方可判试验结果 无效： 对无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结 果不符合无菌检查法的要求； 回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的 因素； 供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证有微生物 生长是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操 作技术不当引起的。 试验若经确认无效，应重试。重试时，重 新取同量供试品，依法重试，若无菌生长 ，判供试品符合规定，若有菌生长判供试 品不符合规定。 若供试品符合无菌检查法的规定，仅 表明了供试品在该检验条件下未发现 被微生物污染。 所有供试品管均无菌生长，方可判供 试品符合规定。 以一次检出为准，除非有证据充分证 明检出的微生物非供试品本身所致， 原检验结果无效，应重试。 无菌检验的局限性 本版药典无菌检查法指出：若供试品符合无菌检 查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未 发现被微生物污