感染相关生物标物姜泓20180621

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1、感染相关生物标标志物空军军军军 医大学唐都医院感染病科姜 泓2018.6目 录录CONTENTS01背 景02传统生物标志物03降钙素原04IL-605G试验和GM试验06-干扰素释放试验01背 景4感染带来的挑战临床决策压力急性临床症状的患者时间成本和治疗成本炎症？感染？是否有炎症？是否有感染？判断病原体？是细菌/病毒/真菌感染？抗生素应用？停药？5临床诊断细菌感染的方法微生物检查01020403n 微生物培养与鉴定n 血清学抗原抗体检测n 分子生物学检测n 标本直接镜检02传统 生物标志物71.外周血白细胞81.外周血白细胞血细细胞变变化可能出现现的临临床情况白细胞升高合并中性粒细胞比例升

2、高急性细菌感染，特别是G+球菌少数病毒感染：流行性乙型脑炎、流行性出血热血液与实体肿瘤；血管炎；成人still氏病肾上腺皮质激素的应用白细胞升高合并淋巴细胞比例升高急性病毒感染如长期升高，除外白血病白细胞升高合并嗜酸粒细胞比例升高寄生虫感染也可见于结核、变态 反应、肿瘤、药物等白细胞减少病毒非典型病原体：支原体、衣原体、立克次体等某些原虫：疟原虫、黑热病原虫某些细菌感染：沙门菌、结核、布鲁菌病某些细菌的严重感染：如脓毒症白细胞正常或减少合并嗜酸粒细胞下降沙门菌感染92.血沉010102020303受感染之外的多种因素影响，如风湿热、恶性肿瘤、妊娠、贫血等影响因素多ESR升高对诊断风湿性疾病的价

3、值远高于感染性疾病对感染诊断价值低感染性疾病中只对结核和植入物感染的诊断有一定参考价值相对特异的两种情况103.C反应蛋白发现较发现较 早1930年发现，能在Ca2+存在时与肺炎链球菌的荚膜C多糖结合1941年证实是一种急性感染时出现的蛋白质（病情恢复后/健康人血清中没有这种物质）五聚体结结构结构对称的盘状五聚体5个相同的非糖基化单体非共价键联接形成每个单体含206个氨基酸残基113.C反应蛋白肝脏脏合成由肝细胞在IL-6、IL-2、TNF刺激下合成，炎症局部巨噬细胞也可少量产生广泛分布在体内分布甚广，血液、胸水、腹水、心包液、关节液中均可测出不能通过胎盘123.C反应蛋白动动力学在感染发生后

4、46h开始升高， 每8h增加1倍36-50 h达到高峰，比正常值可高100-1000% CRP的水平和持续时间与感染的程度呈正相关半衰期短半衰期短(47h)炎症消除后急速下降， 3-7d可恢复正常ESR的升高和恢复滞后于CRP133.C反应蛋白阻滞过过氧化物释释放激活补补体增强NK细细胞活力促凝血IL-1r合成增加抗肿肿瘤效应应与LDL结结合清除染色质质抑制组织组织 蛋白酶等趋趋向性血红红素凝集增加抑制血小板聚集阻滞巨噬细细胞活性对细对细 菌/细细胞的调调理作用CRP生理功能143.C反应蛋白超敏CRPhigh-sensitivity C-reactive protein同普通CRP（检测能力

5、在35mg/L以上）是同一种物质，仅是检测方法不同低度的CRP不足以预测心血管事件的风险采用免疫增强比浊法等技术提高了灵敏度（检测低限为0.0050.10mg/L），这些方法所进行测定的CRP称为hsCRP153.C反应蛋白全程CRP有些检测方法可以一次检测涵盖hsCRP和常规CRP的检测线性，如：免疫荧光方法，检测线性：0.5-200mg/L；可满足临床对新生儿、儿童、成人的感染性疾病的鉴别诊断、监测、抗生素合理应用、心血管疾病危险评估等多种需求163.C反应蛋白CRP升高见于感染、炎症、心梗、手术和创伤当组织损伤或急性感染数小时后即可明显上升（100-1000%）在细菌感染时显著性增高，而

6、病毒感染时增高不明显（正常或轻度升高）高敏C反应蛋白水平高的人患心血管病的风险较高，反之则低 当感染得到控制、创伤消失时迅速下降炎症恢复期，在24h内可下降约50%此反应不受放疗、化疗、抗生素、免疫抑制剂、糖皮质激素治疗的影响手术第2天达高峰，57d后恢复正常。CRP水平和持续时间与病理状态呈正相关不受病人的个体差异、机体状态、机体急性应激反应的影响17细菌或病毒感染鉴别的特异性、灵敏性：CRPWBCESRCRPWBCESR急性炎症反应时间炎症进程开始后 46h明显上升36h50h达高峰当感染控制后血CRP水平迅速下降升高较慢，在炎症早期WBC不如CRP出现的快治疗后变化缓慢* 一般23d才开

7、始升高,治疗后几周后仍不能降至正常影响因素不受病人的个体差异、机体状态和治疗药物的影响易受年龄、日间变化、妊娠与分娩、机体抵抗力、药物治疗等多种混杂因素的影响 ,解热镇痛药、抗生素均可使WBC降低易受年龄、性别、温度、贫血、血沉管位置、药物等因素影响相关疾病的活动性（细菌感染）CRP动态变化能反应疾病的活动性细菌感染增高,病毒感染不增高升高幅度与细菌感染程度呈正相关不受抗生素、免疫抑制剂和激素的影响,直到炎症吸收CRP才恢复正常WBC变化不能反应疾病的活动性WBC正常范围较宽，一些WBC基数低的患儿，轻度升高不会超过正常范围上限部分细菌感染时，患儿WBC不能相应提高，WBC计数及分类指数变化不

8、显著无相关性间接测量纤维蛋白的水平,但其变化范围在病人与健康人之间交叉较大,因而对其正常结果的制定受到影响细菌/病毒感染鉴别能（显著性差异）不易（部分差异不显著）不是可靠指标，尤其是小婴儿不能（无显著差异）03降钙素原19PheAsnLysPheHisThr=Cleavageofendopeptidases=Katacalcin=N-ProCT=Calcitonin56116LysArgCysGlyAsLeuThrSerCysMetLeuGlyThrTyrThrGlnAspPheProGlnThrAlaIleGlyYalGlyAla91ProArgAspMetSer9SerAsGluLeuAr

9、gAspMetSerValProAlaAsnGlnAsnPAMGlyLysLysHisProArgHisPAM=Peptidyl-AmidatingMonooxygenase1AlaProPheArgSerAlaLeuGluSerSerProAlaAspProAlaThrLeuSerGluAspGluAlaArgLeuLeuLeuAlaAlaLeuYalGlnAspGlnYalTyrAlaLysMetGlyGluArgGluGlnGluGlnGluLeuGluSerSerSerProSerAspLeuArgSerPCT分子量1.3万KD, 116AA的糖蛋白需特异的蛋白酶降解，半衰期为25-3

10、0h不受机体免疫抑制状态的影响20PCT的来源左：正常组织组织只有甲状腺和肺组织有少量分泌右：脓脓毒血症身体所有组织都开始分泌PCT21PCT动动力学快速、高特异性的增长在脓毒症情况下，3-6小时即可检测到其水平的增长快速衰减 半衰期约25-30 小时 ，可以快速反映治疗效果Reinhart K, et al. Crit Care Clin 2006;22;503-519在一次内毒素刺激的人体试验中不同的标志物的动力学变化22PCT参考值说明参考值（ng/ml）说 明PCT0.05正常人（基本没有细菌感染）0.05 PCT 0.5轻度局部细菌感染或者细菌感染早期阶段，或病毒感染、自身免疫性疾病

11、、慢性非特异性炎症0.5PCT 2很大可能为全身细菌感染，但应排除是否为出生小于48小时的新生儿、严重外伤、烧伤、较大外科手术、重度心源性休克等临床状态；或继发于细菌之上的真菌感染2 PCT 10全身细菌感染（脓毒症），并且很大可能发展为严重脓毒症PCT 10 严重脓毒症或脓毒性休克23PCT的临床应用鉴别鉴别诊诊断动态动态监测监测预预后提示24PCT的临床应用鉴别鉴别诊诊断发热待查病毒感染、自身免疫性疾病、肿瘤等不升高/轻度升高ARDS细菌性vs非感染急性胰腺炎胆源性vs酒精性脑膜炎细菌性vs病毒性移植术后细菌感染vs排异反应25PCT的临床应用动态动态监测监测危重症患者：复合外伤，大面积软

12、组织损伤，恶性疾病，免疫抑制，长期机械通气患者，PCT浓度会因为细菌感染的发生而PCT升高。手术后患者：小或中等规模的外科手术后，PCT浓度正常，外科大手术，如食管切除和心血管手术，PCT浓度升高，几乎10ng/ml，术后1-4d中，如果浓度在第3天没有下降或者小外科手术后也升高，必须考虑感染并发症。器官移植，免疫抑制：器官移植排斥PCT并不会升高，即使在免疫抑制下，PCT浓度升高也提示细菌或真菌感染，在移植前，PCT可以提示细菌或真菌感染存在的线索。26PCT的临床应用预预后提示 脓毒症：PCT浓度升高提示预后不良 MODS：PCT浓度升高提示预后不良 感染：PCT恢复正常提示抗感染治疗有效

13、27PCT的局限性非感染疾病升高胰腺炎，缺血性肠病，肺水肿，严重创伤，手术，热休克，甲状腺髓样癌终终末期肾肾病 升高终末期肾病患者PCT升高生物标志物的清除下降有关局部感染升高不明显PCT在局灶性感染中正常或仅轻度增高不能作为细菌感染的唯一判定指标04IL-629IL-6非特异炎性标标志物IL-6是一种炎症因子，是炎症介质网络的关键成分，在炎症反应中起重要作用激活时间快速，半衰期约1小时体循环中半衰期最长的前炎症介质IL-6诱导产生CRP和PCTIL-6的产生要早于CRP和PCTIL-6与炎症和脓毒症的严重程度成正比30IL-6 多来源多作用31IL-6诊断炎症及感染性疾病的临界值IL-6的含

14、量临床应用建议7ng/mL表明可能存在炎症或其它感染7-150ng/mL表明存在轻微炎症或轻微的感染150-250ng/mL提示有一般细菌感染或全身性炎症反应250ng/mL提示可能是脓毒症L. Bender, J. Thaarup, K. Varming, H. Krarup,S. Ellermann-Eriksen & F. Ebbesen. Early and late markers for the detection of early-onset neonatal sepsis. Dan Med Bull 2008;55:219-2332IL-6评估脓毒血症患者预后脓毒症患者存活组与

15、死亡组IL-6含量的变化IL-6优优于PCT和CRP 存活者组IL-6浓度快速下降 死亡者组IL-6浓度延迟下降 IL-6下降的动力学用来评估患者的预后要优于PCT和CRP 与PCT和CRP相比，IL-6能更好的评估脓毒症患者预后，能更快的反映抗生素治疗的效果IL-6优优于PCT和CRPDong Wook Jekarl , So-Young Lee , Jehoon Lee , Yeon-Joon Park , Yonggoo Kim, Jeong Ho Park ,Jung Hee Wee , Seung Pill Choi. Procalcitonin as a diagnostic ma

16、rker and IL-6 as a prognostic marker for sepsis, Diagnostic Microbiology and Infectious Disease,2013, 75:342347.05G试验 和GM试验34G试验1-3-D-葡聚糖（BG）可特异性激活鲎变形细胞裂解物中的G因子，引起裂解物凝固，故称G试验。（1-3）-D-Glucan LAL-RM(反应物)G因子活化G因子凝固酶原凝固酶凝固蛋白原凝固蛋白（凝胶）试验反应机理图：35(1,3)-D-葡聚糖 （BG）1,6葡聚糖 磷脂双分子层几丁质麦角固醇1,3葡聚糖合成酶甘露糖蛋白广泛存在于真菌细胞壁中

17、，占真菌壁成分50%以上，是真菌细胞壁上的特有成分, 真菌进入血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞噬、消化，BG从细胞壁中释放出来，血液中BG升高，用于侵袭性真菌感染的早期诊断36鲎37内毒素试验与G试验的原理38G试验可检测多种致病真菌感染念珠菌，曲霉，肺孢子菌，镰刀菌，地霉，毛孢子菌等G试验检测一般先于临床症状平均4天对于念珠菌血症, G试验检测是首选检查J. Clin. Microbiol. 2008.46:10091013. BG值升高平均早于发热5 d 早于呼吸道症状平均107 d 早于HRCT检查平均93 d39G试验 侵袭性真菌病（IFD）早期诊断. 比出现临床症状体征早约10天.

18、比HRCT改变早约9天敏感性与感染程度（真菌负荷量）相关念珠菌定植不引起G试验升高动态反应感染程度和抗真菌治疗疗效儿童BG水平高于成人40G试验浅部真菌感染中，BG未被充分释放，在体液中含量不高接合菌（毛霉、根霉）细胞壁不产生BG隐球菌细胞壁外有荚膜，不易检测到细胞壁上的抗原 41G试验 假阳性：. 抗肿瘤药物：蘑菇多糖、裂褶菌多糖. 免疫药物：白蛋白、球蛋白. 血透使用纤维素膜. 手术中使用棉纱垫、棉拭子等. 脂肪乳等 假阴性：. 棘白菌素类：抑制BG合成42GM试验检测半乳甘露聚糖（glactomannan，GM），主要适于侵袭性曲霉菌感染的早期诊断GM广泛存在于曲霉和青霉细胞壁，细胞壁表

19、面菌丝生长时，GM是最早释放的抗原43GM试验检测法是一种微孔板双抗体夹心法44GM试验 曲霉菌定植时很少释放入血，因此有利于鉴别侵袭与定植 GM释放量与菌量成正比，可反映感染程度 连续检测GM试验可作为治疗疗效的监测 在造血干细胞移植患者中的诊断敏感性高 非特异交叉反应：青霉较多、隐球菌45GM试验假阴性 抗真菌药物 (三唑类-降低GM水平) 低侵袭性曲霉菌病 低曲霉负荷量46GM试验假阳性 抗菌药物：哌拉西林-他唑巴坦(采样：用药前，或药物浓度最低时) 米卡芬净：升高GM水平（能够破坏真菌细胞壁，但不能清除） 高剂量使用激素 透析：不能清除大份子GM 化疗的严重黏膜炎的患者(谷类食物中的G

20、M抗原通过肠道入血) 儿童和新生儿：假阳性占83%（母乳/配方食品中双歧杆菌与GM有交叉反应） 交叉反应真菌：青霉、拟青霉、隐球菌、头状地霉、组织胞浆菌等47G试验+GM试验联合检测 种属GGM念珠菌属+-镰刀菌属+-隐球菌属-+曲霉菌属+青霉/拟青霉+结合菌纲-06-干扰素释放试验49IGRA-干扰素释放分析技术（Interferon-gamma Release Assay, IGRA） 最新的用于结核杆菌感染的体外免疫诊断方法 具有较高的敏感性及特异性 诊断迅速 50IGRAn两种IGRAs用于商业诊断：oT-SPOT.TB (ELISPOT-based IGRA)oQuanti FERO

21、N-TB Gold (ELISA-based IGRA) 51IGRA结核特异抗原 ESAT-6、CFP-10 来自M.TB 基因组RD1区域避免卡介苗、非结核分枝杆菌干扰（缺失RD1区域的基因）52实验过程结核杆菌RD区特异抗原： ESAT-6: Rv3875编码 结核分枝杆菌早期分泌抗原 CFP-10: Rv3874编码 结核分枝杆菌培养滤过蛋白10试剂盒中结核抗原：ESAT-6和CFP-10的重叠肽段RD-1 (M.TB毒力区)Rv3871Rv3879Rv3874 (CFP-10)结核分枝杆菌基因组Rv3875(ESAT-6)53RD1区抗原ESAT-6、CFP-10的特异性结核分枝杆菌

22、群抗原ESAT-6CFP-10Mtuberculosis+Mafricanum+Mbovis+BCG substraingothenburg-moreau-tice-tokyo-danish-glaxo-montreal-pasteur-抗原ESAT-6CFP-10Mabcessus-Mavium-Mbranderi-Mcelatum-Mchelonae-Mfortuitum-Mgordonii-Mintracellulare-Mkansasii+Mmalmoense-Mmarinum+Moenavense-Mscrofulaceum-Msmegmatis-Mszulgai+Mterrae-M

23、vaccae-Mxenopi-环境分支杆菌54实验过程55ESAT-6、CFP-10刺激患者外周血T淋巴细胞产生-干扰素 NTPPHA植物血凝素: 刺激T淋巴细胞产生-干扰素 一个人感染了结核 产生-干扰素一个人未感染结核 不会产生-干扰素实验原理56实验过程基于ELISPOT技术术，计计数分泌IFN-的效应应T淋巴细细胞数目57实验过程NTP222hNTP离心血浆6点定标 夹心法 -IFN2h2个工作日58实验过程 基于外周血单单个核细细胞（PBMC）的ELISPOT 技术术，敏感性更高。 每例样样本同时检测时检测 4个孔： 阴性对对照孔(N): 无任何抗原刺激 TB抗原孔(A): ESAT

24、-6 (panel A) TB 抗原孔(B): CFP-10 (panel B) 阳性对对照孔(P): 植物凝集素抗原(PHA) (刺激所有T细细胞都能释释放r-干扰扰素)59结果判读斑点相减ABCD 20通常正常结果，空白对照孔没有或很少斑点（20个。60结果判读61结果判读阴性结果提示患者体内不存在针对结核杆菌特异的效应T 细胞假阴性：感染阶段不同少数免疫系统功能不全/ 基础疾病，如重症 HIV 患者、肿瘤患者、婴幼儿等样本不正常保存与运输，实验非正常操作62结果判读阳性结果提示患者存在结核感染是否为活动性结核病，需结合临床症状和其它检测指标综合判断假阳性3 种环境分枝杆菌感染时：M.kansasii 、M.marinum、M.szulgai63结果判读HIV/AIDS器官移植抗肿瘤坏死因子或糖皮质激素的治疗恶性肿瘤慢性肾功不全/ 血液透析对于免疫缺陷的患者，IGRA敏感性降低64结果判读对于卡介苗接种的患者 特异性明显高于结核菌素试验（TST） 免疫水平对IGRA结果的影响小于TSTIGRA难以区分活动性结核和潜伏性结核感染IGRA测值并不与结核活动程度呈正相关不建议将IGRA作为判定疗效的决定性指标TST会影响IGRA检查结果 感谢聆听！汇报汇报人：姜泓时间时间：2018.06