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1、山东大学硕士学位论文凋亡抑制基因Survivin在宫颈癌中的表达及其意义的研究姓名：解梅林申请学位级别：硕士专业：妇科肿瘤指导教师：张师前张培海20040512原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个入或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：筮鲢日期!型二璺Jp关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允
2、许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名：鲤蛰师签名：日期：生竺二!：!：山东大学硕士学位论文凋亡抑制基因Survvin在宫颈癌中的表达及其意义的研究硕士研究生解梅林导师张师前张培海中文摘要【目的1测定正常宫颈组织及宫颈癌组织中中凋亡抑制基因Survivm的表达，并探讨Survivin与宫颈癌发生、发展的关系。【方法】选择山东省肿瘤防治研究院妇瘤科2001年5月至2003年2月的宫颈癌手术标本49例。正常宫颈组织10例，宫颈癌患者49例，最小
3、年龄21岁，最大年龄72岁，平均年龄568岁。依据宫颈癌临床分期(FIGO1995)：Ia期9例，Ib期的12例，IIa期28例。按病理学形态分为：宫颈鳞癌40例，宫颈腺癌6例，透明细胞癌3例，按分化程度分为高中分化38例，低分化11例，按形态学分为：外生型28例，内生型17例，溃疡型4例。采用免疫组织化学技术检测抗凋亡基因Survivin蛋白的表达。Survivin的阳性表达呈棕黄色，主要定位于细胞浆。随机选择每张切片的10个高倍视野共记录1000个宫颈癌阳性细胞表达百分比并结合染色强度进行评分，以二者乘积为最后得分；0分为阴性，卜4分为阳性(+)，大于4分为强阳性(+)采用统计学x2检验结
4、果Survivin在正常宫颈组织中不表达，其在宫颈癌组织中阳性表达主要位于细胞浆，宫颈癌组织中Survivin的阳性率为837(4149)，正常对照组为0(010)，两组相比有显著差异(PO0540(100O)1(166)0(O)O0524(857)14(823)3(748)005G卜G23830(78哟IG31llO(999)005淋巴转移阳性3231(969)阴性179(52。9)o058墙毖00嬲0山东大学硕士学位论文讨论目前，国际上对肿瘤发生分子机制的基础研究主要集中在肿瘤相关的基因的克隆和功能分析、细胞信号传导通路以及细胞周期调控三大领域。即在分析肿瘤细胞基因的变异即DNA一级结构的
5、改变，如DNA序列突变、丢失、扩增及易位等在恶性肿瘤发生发展中的作用的基础上，拓展到研究DNA染色质结构的改变与基因调控的相互关系。并已发现结构改变是一些抑癌基因如Rb、P16、APC等失活的重要原因。DNA染色质结构的改变主要是cpG序列中胞嘧啶的甲基化、去甲基化等。近年来M期检测点和纺锤体检测点在肿瘤的发生中日益受到重视。通过对细胞周期的研究，可为临床治疗肿瘤提供充分的理论依据。细胞凋亡。即细胞程序性死亡(programmedeelldeathPCD)此概念是在20世纪60年代正式提出。1972年，澳大利亚科学家Kerr首次引用apoptosis(凋亡)形象地描述和命名这种不同于一般病理坏
6、死的细胞死亡现象。Apoptosis取自希腊文，含有树叶凋落之意。细胞凋亡是主动的，由体内基因调控的正常生命活动。在哺乳类动物细胞中，根据功能的不同，大致可以分为几大类：caspase家族、Apaf蛋白、bcl-2家族、细胞色素C(cytochromeC)、TNF和TNF受体家族、lAP家族(inhibitorofapoptosisproteins)等，lAP家族哺乳动物基因组中的成员Survivin不仅能够控制细胞凋亡，而且在促进细胞增殖、细胞转化中具有重要作用，很可能成为肿瘤治疗的新靶点。细胞周期的运行主要受到细胞周期蛋白(cyclin)、细胞周期依赖性激酶(CDK)和细胞周期蛋白依赖性激
7、酶抑制因子(CKI)及其相应的基因群和底物群所组成的网络体系的精确调控“1。这一系列细胞周期调控蛋白在肿瘤的发生中起着重要作用。细胞周期调控的几种途径如下：作用于cyclinCDKCKI途径。CDK是细胞周期网络调控的核心，它们与相应的cyclinD与CDK49(6)复合物，cyclinCDK2以及cycIinE-CDK2以及cyclinA-CDK2等复合物。CDK的活性受到两类CKI家族的抑制，cyclinCDK-CKI构成一个精确的调控网络，对细胞山东大学硕士学位论文内外信息整合的结果作出细胞增殖或停滞的决定。作用于PRb途径。Rb基因产物(PRb)是cyclin-CDK复合物最重要的磷酸
8、化酶，它在去磷酸化状态下，与核转录因子E2F结合，从而抑制了E2F转录调节活性。CyclinCDK复合物可磷酸化PRb使之失活，从而释放出E2F因子，促使一系列进入S期的必须基因的转录，如cyclinE、cyclinA、DNA聚合酶等。作用于P53途径。P53蛋白是细胞生长周期中至关重要的负调节因子，人类肿瘤约50以上由P53的失活。P53局转录调节活性，可上调一些在细胞周期调控中起关键作用的基因，如调节CDK活性的P21及抑制DNA合成的GADD45，从而使细胞G；一S检测点失效，加速细胞周期运行是致瘤蛋白最常用的致瘤策略。作用于CBP(P300)途径。CBP(P300)是一类转录辅助激活因
9、子，转录因子P53，AP一1等结合，参与一系列对分化至关重要的基因调控。CBP(P300)在细胞调控中发挥负调控活性。细胞的凋亡是细胞的两种死亡方式即坏死和细胞凋亡之一。细胞凋亡可通过各种生理的或病理刺激引发或抑制，与细胞坏死不同，它是个生理过程，发生在非相邻的细胞，通常不伴有炎症，细胞表现为核浓缩、细胞浆中细胞器密集、包膜突起、体积缩小、DNA断裂细胞往往脱落离体或裂解为若干凋亡小体而被细胞吞噬。即在凋亡过程中，首先，单个细胞与邻周细胞脱离，胞浆浓缩，而后，胞浆内的细胞器凝聚。染色质浓缩，密度增高，呈半月形，且靠近核膜核仁裂解，染色质浓缩是细胞凋亡的一个主要形态学变化特征，最后核破裂，细胞表
10、面凸起，形成含有染色质碎片的芽体，而后变成凋亡小体被吞噬细胞吞噬。凋亡的死亡过程可导致溶酶体及细胞膜破裂，没有细胞内含物外泄，故在凋亡细胞中一般无炎症反应出现“3。在肿瘤的研究与治疗中，人们逐渐认识到，细胞群体的数量不仅与细胞增殖速率有关，也与细胞死亡的速率有关。如果细胞已正常的速率增殖或增殖太快，而该死亡的细胞不死亡或死亡太慢，这都将导致细胞群体数量增加，许多肿瘤正是由于细胞增殖与死亡的速度失调造成的。在化学致癌的过程中，一般化学致癌即是通过调节或诱导控制正常生长的基因发生突变而导致癌细胞的形成。以前研究认为，由于化学致癌剂的作用，激活了癌基因，导致癌细胞的无限增殖，近年来研究发现，细胞凋亡
11、在癌的发生过程中也起重要作用。许多致癌剂是非遗传性的，不直接与DNA反应，非遗传性致癌剂可诱发细胞的增殖，减少细胞的凋亡，0山东大学硕士学位论文增加细胞的突变率，促进了突变细胞的存活，突变细胞出现生长优势，从而使靶组织发生改变。研究证明，集体整个的多阶段的致癌过程中，细胞死亡起到一定的作用。通过检测癌细胞发生过程中正常组织、癌前病变组织及癌组织中与生长有关的变化情况，可以研究细胞死亡的调节机制，以及凋亡在致癌过程中的重要作用。促进细胞凋亡减少DNA受损细胞和癌启动细胞，可以抑制肿瘤生长。若抑制细胞凋亡，则增加了癌前细胞群体的生存和扩增，凋亡过程的失调等启动细胞的生存和过度生长。细胞凋亡是机体的
12、一种基本生理机制。并贯穿于机体的整个生命活动过程，包括胚胎的发育、新旧细胞的交替、某些组织的正常退化与萎缩、增生或肿瘤细胞的自发抑制等。无论是低等动物或高等动物都能观察到细胞凋亡现象，如昆虫与两栖类的蜕变在人类胸腺中T淋巴细胞的分化成熟过程中，95前T淋巴细胞死亡，又有成熟淋巴细胞也只有很短的寿命，机体内衰亡、损伤与突变细胞的清除，均有赖于细胞凋亡的发生。总之。细胞凋亡是维持机体正常生理功能和自身稳定的重要机制，具有重要的生物学意义。细胞凋亡与细胞发生有关。早在1967年Iversen等就提出，肿瘤不仅是细胞增生异常的疾病，而且是死亡异常的疾病，即不仅是由于细胞增生过度，亦是因细胞死亡过低，总
13、之是增生与死亡失调所致。在实体肿瘤组织中可见两种类型的细胞死亡：一类是散布于小结中心的固块细胞坏死；另一类是散布于整个肿瘤组织中的细胞凋亡。细胞凋亡存在于所有肿瘤组织中。大多数抗癌药物如拓扑异构酶抑制剂、烷化剂、抗代谢剂和激素等。均可在不同类型的敏感肿瘤中诱导细胞凋亡。抗癌药物的疗效不仅取决于他们对靶细胞的直接作用，而且也取决于他们诱导肿瘤细胞凋亡的能力。细胞凋亡和病毒性感染有关。人类免疫缺陷病毒HIV感染后的c砜缺失机制与细胞凋亡有关。HIM的gpl20或gpl20抗gpl20复合物结合cD。，使cD。受体发生交叉联结，触发细胞凋亡程序，而引起T细胞的进行性缺失。1，无症状的HIV感染者的e
14、D。细胞在体外经MHClI类依赖性超抗原作用后可发生细胞凋亡。HIV感染所值得T细胞缺失，似乎不是由于病毒的直接作用，因为在发生细胞凋亡的T细胞中只有很少一小部分感染HIV。Ando等报道HBV的致病机制与细胞凋亡有关，应用转基小鼠模型证明，抗原特异性cTL与ItBV阳性肝细胞相互作用，能使山东大学硕士学位论文后者发生细胞凋亡。流感病毒能使培养的Hela细胞等发生核染色体DNA裂解和染色质固缩，其机制可能与该病毒诱导细胞凋亡基因Apo1(ras)的表达有关。有些病毒可抑制细胞凋亡的发生。有认为EBV所致的B细胞的特异性感染是由于该病毒产生的编码产生8种与病毒产生感染有关的蛋白。抑制了B细胞凋亡
15、的发生。细胞凋亡的抑制有利于感染宿主细胞内病毒的复制增殖“1。细胞凋亡与细菌性感染有关晒。致病细菌与病主间存在着复杂的相互关系。致病菌既可引起宿主细胞的坏死，又可诱发宿主细胞凋亡。已报道弗氏志贺菌杀死巨噬细胞的机制是诱导细胞凋亡。用大肠杆菌、金黄色葡菌球菌与绿脓杆菌等经腹腔注射途径致小鼠败血症时，可使胸腺发生细胞凋亡，胸腺细胞呈现抗固缩和产生凋亡小体，DNA电泳时出现阶梯状区带“1。一些细菌毒索如白喉毒素可诱导细胞凋亡。金葡菌的毒素B可诱发被刺激的T细胞发生细胞凋亡，使T细胞数减少，伴发低或无反应性。细胞凋亡与免疫细胞命运。已只有两个基因与免疫细胞发育和命运密切有关。一个是bcl-2基因，一个
16、是Fas基因。Bcl一2编码一种线粒体蛋白，能抑制细胞凋亡的发生。B细胞一般成熟后卜2天即死亡，但若遇抗原刺激，就启动bcl一2基因的转录，抑制细胞凋亡，成为长寿命的记忆性B细胞。自然性B细胞的短寿命，促成其组成的多样性，每24小时，10”个常有独特受体的新克隆B细胞进入血循环，那些没有与抗原相遇的B细胞被排除。Bcl一2基因对T细胞同样重要，在胸腺皮质内，bcl-2基因的转录很少或无，但在输送成熟T细胞质外周血的胸腺髓质中，bcl一2基因的转录很高。因此在克隆缺失中，那些不能排除固有死亡程序的T细胞死亡，而在阳性选择中，那些激活bcl一2基因转录的T细胞存活。第二个Fas基因或Apo-1基因，编码一种与神经生长因子受体和TNF受体同源的48KD跨膜蛋白。已证明Fas膜蛋白的结合能发细胞凋亡，作用与bcl一2基因相反。细胞凋亡的基因调解。肿瘤抑制基因P53在调节细胞增生中起着重要作用。它抑制细胞的异常增生和肿瘤发生”。1。P53功能的丧失，在体外引起细胞的永生。在体内引起肿瘤
