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1、中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名： 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在 攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离 校后
2、，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师 为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学 校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩 印或其他手段保存论文。 论文作者签名： 指导教师签名： 日 期： 专 必爷 J oI J f 、c 、， 一、摘要 中文论著摘要 英文论著摘要 二、英文缩略语 三、论文 x j 一 刖菩“ 材料与方法 结果 讨论 结论 四、本研究创新性的自 五、参考文献 六、附录 综述 在学期间科研成绩 致谢 个人简介 中文论著摘要 3 0 4 -
3、 C u 抗菌不锈钢材料的细胞毒性评价 目的 矫治装置是正畸临床治疗中最常用的功能部件，包括：托槽、带环、弓丝、 矫治附件和正畸支抗种植体等。矫治装置材料的性能可以影响矫治力的施加效果， 对提高矫治质量和缩短矫治疗程起到重要的作用。目前临床上应用的多数矫治装 置是由医用不锈钢材料制成，它具有优良的力学性能，耐腐蚀性和良好的可加工 性。但医用不锈钢本身不具有抗菌作用，当这些矫正装置应用于口腔环境后，降 低了口腔自洁作用，破坏了口腔正常菌群的生态平衡，菌斑易于堆积于矫治装置 周围，不利于口腔卫生的保持，容易导致龋病，牙龈炎，牙周炎，支抗种植体周 围炎等细菌感染性疾病，不仅危害患者健康，更延长了矫治
4、的过程。近年来，中 国科学院金属研究所研制出3 0 4 - C u 抗菌不锈钢，它具有普通不锈钢的优良性能， 而且它的抗菌有效性已经过诸多实验研究被证实。本实验旨在评价抗菌不锈钢材 料的细胞毒性，并与临床常用的医用不锈钢材料以及纯钛材料进行比较，为其进 一步的临床应用提供生物学证据。 方法 本实验通过体外实验的方法对材料进行研究，选择L - 9 2 9 细胞系作为实验对 象，将实验材料分为普通不锈钢、抗菌不锈钢、纯钛三个实验组，并设立空白对 照组和阳性对照组。通过细胞形态学观察、C C K 一8 实验和流式细胞术实验评价抗 茵不锈钢材料对细胞毒性的影响。在三种材料的浸提液与细胞作用2 4h 、
5、4 8h 、 7 2h 后，用倒置相差显微镜观察L _ 9 2 9 细胞的数量、形态以及生长情况；通过 C C K _ 8 实验得出光密度值并计算得出细胞相对增值率，判断细胞毒性级别；通过 流式细胞仪A n n e x i nV F I T C P I 双染法观察在不同合金浸提液中培养的小鼠成纤 维细胞的散点图，并计算各组细胞凋亡率，对抗菌不锈钢材料做出细胞毒性评价。 结果 倒置相差显微镜观察结果：培养2 4h ，普通不锈钢组，抗菌不锈钢组，纯钛 组，空白对照组细胞贴壁生长状态良好；阳性对照组细胞生长状态异常。培养4 8 h ，普通不锈钢组，抗菌不锈钢组，纯钛组，空白对照组细胞生长旺盛，排列密
6、集 规则；阳性对照组细胞固缩。培养7 2h ，普通不锈钢组，抗菌不锈钢组，纯钛组， 空白对照组细胞布满视野，未见异型性；阳性对照组均为死亡细胞和碎片。 C C K - 8 实验结果：随着培养时间的延长，普通不锈钢组，抗菌不锈钢组，纯 钛组，空白对照组的光密度值均相应的增加。各时点普通不锈钢组，抗菌不锈钢 组的光密度值均低于纯钛组和空白对照组( P 0 0 5 ) 。空白对照组各时间点细胞毒性均为0 级，纯 钛组，普通不锈钢组，抗菌不锈钢组各时间点细胞毒性均为1 级。 流式细胞术实验结果：各组细胞均以正常细胞和凋亡细胞为主，坏死细胞较 少。凋亡细胞在各组间分布不均，普通不锈钢和抗菌不锈钢组的凋亡
7、细胞多于空 白对照组。细胞凋亡率在普通不锈钢、抗菌不锈钢组之间无统计学差异俨 0 0 5 ) ， 但这两组的细胞凋亡率均高于空白对照组，差异有统计学意义泸 O 0 5 ) B u tt h ea p o p t o t i cr a t ei n t h e s et w og r o u p sw e r eh i g h e rt h a nb l a n kc o n t r o lg r o u p 俨 O 0 5 ) C o n e l u s i o n T h e r ew a sn os t a t i s t i c a ld i f f e r e n c eb e t w
8、 e e nt h ec o m m o ns t a i n l e s ss t e e lg r o u pa n d 4 a n t i b i o t i cs t a i n l e s ss t e e lg r o u p T h ea n t i b i o t i cs t a i n l e s ss t e e lm a t e r i a li si nl i n ew i t ht h e r e q u i r e m e n to fi t sc l i n i c a la p p l i c a t i o n T h er e s u l t so fe
9、x p e r i m e n tp r o v i d eab i o l o g i c a l b a s i so ft h ea n t i b i o t i cs t a i n l e s ss t e e lm a t e r i a l K e yw o r d s C y t o t o x i c i t y ；a n t i b i o t i cs t a i n l e s ss t e e l ；C C K 一8t e s t ；a p o p t o s i s 5 。一 英文缩略语 O D o p t i c a ld e n s i t y 光密度 P B
10、 S p h o s p h a t eb u f f e r e ds o l u t i o n 磷酸盐缓冲溶液 F B S f e t a lb o v i n es e r u m 胎牛血清 R G R r e l a t i v eg r o w t hr a t e 相对增殖率 F C M f l o wc y t o m e t r y 流式细胞术 一 6 论文 3 0 4 - C u 抗菌不锈钢材料的细胞毒性评价 刖肓 矫治装置是正畸临床中最常用的功能部件，包括：托槽、带环、弓丝、矫治 附件和正畸支抗种植体等。矫治装置材料的性能在定程度上影响了矫治效果和 疗程长短。长期以来，医
11、用不锈钢材料n 以其优良生物相容性、力学性能、耐腐 蚀性和良好的加工性能在口腔J 下畸领域得以广泛应用。但不锈钢材料也有不足之 处：不锈钢材料本身不具有抗菌性能。而且口腔环境是有菌环境，具有复杂的生 化特点，正畸治疗的过程中时刻面临着口腔微生物的挑战。在正畸治疗中，由于 矫治装置的存在，给牙齿的清洁带来一定的困难，牙菌斑容易滋生，堆积在托槽 周围和牙齿表面，造成牙齿脱矿、龋病、牙龈炎瞳1 、牙周炎b 1 等病变。临床上微小 支抗种植体的松动、脱落，相当一部分原因是由于种植体颈部菌斑堆积H 1 所造成， 致病菌通过菌体表面物质、产生的毒素及代谢产物等破坏支抗种植体周围软组织 封闭屏障以及骨性结合
12、界面，导致种植体周围炎并最终出现骨性结合界面丧失， 种植失败。 为了解决这一问题，许多学者开始致力于抗菌金属材料的研究，以期望从根 本上减少矫治过程中细菌感染性疾病的发生。近年来，中国科学院金属研究所结 合一些金属元素的抗菌活性和不锈钢材料的可加工性以及耐腐蚀性研制出一种 3 0 4 - C u 抗菌不锈钢，经研究证明，抗菌不锈钢具有广谱抗菌性，而且抗菌效果良 好，抗菌时效长，能够有效地杀灭引起支抗种植体周围炎的主要致病菌璐1 。而且 抗菌不锈钢还具有医用普通不锈钢的耐腐蚀性、成形性好、化学性能稳定、结构 形状稳定等优点1 ，如果可以替代普通不锈钢制成矫治装置，将减少矫治中由细 菌所引起的一些
13、口腔疾病的发生，将有助于正畸治疗的进行。 但抗菌不锈钢是否具有良好的生物相容性是其临床应用的前提。本研究旨在 7 采用活细胞计数试剂盒C C K - 8 法n 澳8 定小鼠成纤维细胞L 一9 2 9 在不同合金浸提液 中培养2 4h 、4 8h 、7 2h 的吸光度( O D 值) ，计算细胞相对增殖率( R G R ) ，检测抗 菌不锈钢材料的细胞毒性，并与正畸临床常用的两种材料，纯钛材料和普通不锈 钢材料比较；采用流式细胞仪A n n e x i nV F I T C P I 双染法观察不同合金浸提液中培 养的小鼠成纤维细胞L - 9 2 9 的散点图，并计算各组凋亡细胞的比例。评价抗菌不
14、锈 钢材料的生物相容性，为临床应用提供生物学依据。 材料和方法 一、材料和仪器 ( 一) 细胞株 小鼠成纤维细胞L - 9 2 9 ( 二) 供试材料 普通不锈钢3 0 4 抗菌不锈钢3 0 4 一C u 纯钛 ( 三) 主要试剂 胎牛血清 1 6 4 0 培养液 胰蛋白酶 H e p e s 庆大霉素 C C K 8 A n n e x i nV F I T C P I 双染试剂 ( 四) 主要仪器设备 中国医科大学中心实验室提供 3 7 ，饱和湿度5 的C 0 2 环境中培养 主要成分：C r1 8 ，N i9 ，其余为F e 等 主要成分：C r1 8 ，N i9 ，C u3 8 ，其余
15、 为F e 等 主要成分：n 三种材料均由中国科学院金属研究所提供 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 G i b c o , A m e r i c a nC o m p a n y G i b c o ，A m e r i c a nC o m p a n y S i g m a ，A m e r i c a nC o m p a n y 天津药业集团新郑股份有限公司 碧云天生物研究所，中国 宝赛生物工程公司，中国 8 9 6 孔培养板 C 0 2 叵温培养箱 T E 2 0 0 0 S 倒置相差显微镜 B X 6 0 F 5 系统显微镜 自动酶标检测仪 超净工作台 流式细胞仪F A C
16、S C a l i b u r 二、方法 C o s t a r ，A m e r i c a nC o m p a n y H E R A c e l l15 0 ，G e r m a n i cC o m p a n y N i k o ，J a p a n e s eC o m p a n y O l y m p u s ，J a p a n e s eC o m p a n y S u n r i s e , A u s t r a l i a nC o m p a n y 苏州安泰空气技术有限公司 B D ，A m e r i c a nC o m p a n y ( 一) 合金试件及其浸提液的制备 将普通不锈钢，抗菌不锈钢，纯钛材料制备成1 5 2 0m m 、厚度0 0 8m n l 的长方形试件，依次
