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1、JIANGXI AGRICULTURAL UNIVERSITY本 科 毕 业 论 文题目：维生素C修饰的纳米硒抗菌性能研究学 院： 食品科学与工程学院姓 名： 学 号： 专 业： 食品质量与安全班 级： 指导教师： 职 称：讲师二0 一 七 年 五 月目录摘要IAbstractII引言11 实验材料与设备21.1 实验材料21.2 主要仪器设备22 实验方法22.1 试剂的配置22.2 实验仪器的准备32.3 斜面活化和菌悬液的制备32.4 VcSe样品梯度浓度32.5 菌种稀释度的选择32.6 VcSe抑菌作用的测定32.7 半数抑菌浓度的测定43 实验结果43.1 菌种稀释度选择的结果43
2、.2 抑菌圈测定结果43.3 半数抑菌浓度的测定结果54 结论6参考文献8致谢9摘要 本文以维生素C修饰的纳米硒（VcSe）为研究对象，采用滤纸片抑菌法、带毒平板法，测定其对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌效果。实验结果表明随着VcSe浓度的增加对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径也随之增加，且其半数抑菌浓度为1.5 mg/L。然而，VcSe对枯草芽孢杆菌没有抑菌作用。实验表明VcSe对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌效果。关键词：VcSe；抑菌作用；滤纸片抑菌法；半数抑菌浓度。IAbstract In this paper, we used vitamin C to modify nano-seleniu
3、m (VcSe) which as the object of study, and using filter paper antibacterial method, drug plate method to determine its Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis antibacterial effect.The results showed that the diameterofStaphylococcusaureus bacteriostatic wasincreased with the increasement of conc
4、entration of VcSe, and the half inhibitoryconcentration ofitwas1.5mg/L.However, VcSe hasnobacteriostaticeffectonBacillussubtilis. Experimentsshowedthat VcSe hasagoodbacteriostaticeffectonStaphylococcusaureus.Key words: VcSe; bacteriostasis; filter paper antibacterial method; half inhibitory concentr
5、ation.II引言 细菌抗药性已成全球日益突出的问题，过度使用抗菌药物、抗生素品种及剂量选择错误、抗生素给药途径、给药次数的不规范增加了细菌的抗药性1。我国作为抗生素的生产和消费大国，由于长期药物不合理使用及监管的缺乏，导致的抗生素耐药性问题十分严峻，耐药感染性疾病已成为当前临床感染性疾病死亡的主要原因2。因而，对新型的非抗生素类抗菌物质的需求日益迫切。 维生素C（又名抗坏血酸）与人体健康关系密切，是一种重要而特殊的水溶性维生素，具有分子结构最为简单，理化性质不稳定的特征，但维生素C可促进人体抗体的形成，提高白细胞的吞噬能力，提高人体对疾病的抵抗力和对寒冷的耐受力，从而增强人体的免疫功能3。
6、硒作为人体所必需的微量元素，是谷胱甘肽过氧化物酶的重要成分，具有广泛的生理功能和药理功能，微量元素硒的生物功能主要通过含硒酶来实现，如调节免疫、抑制病毒的突变、减弱一些致病菌的致病力、预防癌症等4。研究表明，亚硒酸钠对金黄葡萄球菌有抑菌作用，且随浓度的增大抑菌能力增强5。然而，硒的生物效应和毒性浓度范围相当的狭窄稍微超过了营养水平便会表现出毒性6。纳米硒的诞生，解决了硒的应用难题。纳米硒属于硒的一种，具备了无机硒的生物活性，并且纳米硒具有较其更高的活性和安全性，对于人体来说具有更快的吸收效率和更低的毒性，这可避免了传统硒的副作用，是目前最安全的硒制品7。Vc修饰的纳米硒可以克服Vc易被氧化、亚
7、硒酸钠不稳定及毒性较大等缺点，因此，本实验利用VcSe溶胶作为研究对象，选用滤纸片法和它对金黄色葡萄球菌及枯草杆菌的半数浓度这个指标的抑菌效果来研究其抑菌效果，探究VcSe其抗菌功能，为VcSe作为纳米材料类抑菌剂的应用提供理论依据。1 实验材料与设备1.1 实验材料试剂名称规格产地氯化钠盐酸分析纯分析纯天津市永大化学试剂开发中心西陇化工股份有限公司氢氧化钠（粒）分析纯天津市欧博化工有限公司琼脂粉250g北京奥博星生物技术有限责任公司蛋白胨250g北京奥博星生物技术有限责任公司牛肉膏500g北京奥博星生物技术有限责任公司1.2 主要仪器设备仪器名称产地BS224S电子天平北京赛多利斯仪器有限公
8、司GPX-9248A 干燥箱上海跃进医疗器械有限公司SB3200DTDN 超声波清洗机宁波新芝生物科技股份有限公司D-1型自动蒸汽灭菌锅北京发恩科技有限公司SPX-250- 生化培养箱上海跃进医疗器械有限公司电子万用炉SHA-C水浴恒温振荡器北京市永光明医疗仪器厂金坛市天竟公司2 实验方法2.1 试剂的配置 NaOH试剂的配置：准确称取粒状 NaOH 4.0 g置于250 mL的干净烧杯中，用量筒量取蒸馏水98 mL左右后再用滴管滴定至100 mL，倒入烧杯中用玻璃棒摇匀，待完全溶解后用保鲜膜封口。 牛肉膏蛋白胨固体培养基的配置：蛋白胨2.0 g，牛肉膏0.6 g，NaCl 1.0 g，琼脂3
9、.0 g，水200 mL：将除琼脂外的其他成分溶解在水中，用1.0 mol/L的 NaOH溶液将pH滴定到7.4左右；加入琼脂后用电子炉加热溶解，放入自动蒸汽灭菌锅中灭菌20 min。 牛肉膏蛋白胨液体培养基的配置：蛋白胨2.0 g，牛肉膏0.6 g，NaCl 1.0 g，水200 mL：将全部成分溶解在水中，用1.0 mol/L的NaOH溶液将pH滴定到7.4左右；放入自动蒸汽灭菌锅中灭菌20 min。2.2 实验仪器的准备 将实验需要的试管、培养皿洗干净烘干，镊子、滤纸片、涂布器和装盒好的移液枪头用报纸包好于灭菌锅中灭菌20 min，待气压为零时取出，放入干燥箱中烘干备用。2.3 斜面活化
10、和菌悬液的制备 金黄色葡萄球菌、枯草杆菌菌种活化：在无菌室中用配好的固体培养基倒入2只试管中，倒入的量为试管容量的1/4，将试管倾斜冷却凝固。 用过酒精灯火焰后的接种环从已经长好的菌种中挑取少许菌种用斜面画线法进行接种。培养2天之后，取已经活化的的菌种用接种环挑取两环于液体培养基中摇匀，放入摇床培养12 h后放入4 冰箱备用。2.4 VcSe样品梯度浓度表1 VcSe样品浓度梯度3.0mg/L2.5mg/L2.0mg/L1.5mg/L1.0mg/L0.5mg/LVcSe100.0 L83.0 L67.0 L50.0 L33.0 L17.0 L蒸馏水0.0 L17.0 L33.0 L50.0 L
11、67.0 L83.0L2.5 菌种稀释度的选择 将两种菌悬液分别用移液枪取100 L菌悬液于900 L水的试管中摇匀，再取100 L加入900 L水中，如此重复，分别将稀释度定为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，用移液枪取200 L的稀释后的菌液加到准备好的培养基上，用涂布器将其涂匀，用相同的方法将另一种菌液重复操作后，把完成的培养基放入37 培养箱中24 h，观察生长情况。2.6 VcSe抑菌作用的测定 实验采用滤纸片法8对VcSe的抗菌能力的测定，首先准备7 mm的圆形滤纸片若干灭菌，烘干；用移液枪将配制好的VcSe样品按不同浓度取出100 L分别置于9个灭菌完的
12、试管中，这里选择3.0 mg/L、2.0 mg/L、1.0 mg/L的样品进行实验，用镊子夹取滤纸片放入9个试管中浸泡2 h后无菌风干。将灭完菌的培养基冷却至60 倒入培养皿中，每个培养皿为20 mL左右，倒完后水平放置培养皿，待培养基凝固。用移液枪取100 L菌悬液于900 L水的试管中摇匀，再取100 L摇匀后的菌悬液放入900 L水中，重复一次将菌液稀释为10-3。用移液枪取100 L稀释完的菌液于培养皿上，用涂布器涂匀后再用镊子呈正三角形放入泡完样品风干后的圆形滤纸片，每种菌样都放三片不同浓度的滤纸片，放入37 培养箱中倒置培养24 h，观察结果。2.7 半数抑菌浓度的测定 采用带毒平
13、板法9对金黄色葡萄球菌进行实验，将菌种分别用移液枪取100 L菌悬液于900 L水的试管中摇匀，再取100 L摇匀后的菌悬液放入900 L水中，重复两次，将菌液稀释到10-3备用。将3.0 mg/L的VcSe样品按梯度稀释至2.5 mg/L、2.0 mg/L、1.5 mg/L、1.0 mg/L、0.5 mg/L。然后把稀释好的菌液取100 L和每个梯度浓度的样品取出100 L混合摇匀后加入培养基，用涂布器涂匀后放入37 培养箱中培养24 h，观察结果。3 实验结果3.1 菌种稀释度选择的结果 通过平板计数法，根据菌种生长情况、分布均匀程度、分布密度情况，三种菌种都在10-3这个稀释度有着良好的
14、生长，所以将后续试验稀释度定为10-3。3.2 抑菌圈测定结果采用滤纸片法检测VcSe溶胶对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌效果,实验结果如图3.2-1所示VcSe溶胶对金黄色葡萄球菌的抑菌圈非常明显，与枯草芽孢杆菌相比较效果会更好，而枯草芽孢杆菌几乎没有出现抑菌圈。2.0mg/L1.0mg/L2.0mg/L1.0mg/LBA3.0mg/L3.0mg/L图3.2-1 不同浓度的VcSe溶胶对两种菌的抑菌效果图A为金黄色葡萄球菌 图B为枯草芽孢杆菌3.3 半数抑菌浓度的测定结果实验对照如图3.3-1 左图为只加了200 L金黄色葡萄球菌菌悬液，右图为培养基未被污染的空白平板。稀释度为10-3时，平板上上培养两天后，生长的金黄色葡萄球菌菌落个数为71个。 图3.3-1 左图为金黄色葡萄球菌的空白对照右图为空白平板 通过带毒平板法
