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1、河北农业大学 硕士学位论文 农杆菌介导的大丽轮枝菌的遗传转化 姓名：韩绍辉 申请学位级别：硕士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：朱宝成 2009-06-05 摘 要 棉花黄萎病菌引起的棉花黄萎病（Vercicillium wilt）是棉花生产上一种严重的真菌 病害，在世界主要棉花产区都曾造成过严重的经济损失。我国属于产棉大国，多年以来 一直受到黄萎病的困扰， 在我国发现的致病菌为大丽轮枝菌 （Verticillium dahlia） 。 目前， 致病相关基因功能研究的最直接的方法是通过创建该基因的确是突变体， 进一步观察突 变 体 表 型 上 的 变 化 ， 进 而 推 测 该 基 因
2、的 功 能 。 农 杆 菌 介 导 （ Agrobacterium tumefaciens- mediated transformation, ATMT） 的遗传转化技术， 以其特有的有点成为研究 真菌与其寄主互作的有力工具。 本研究利用 ATMT 技术，创建了大丽轮枝菌 V- 190 的突变体，并对部分突变体进 行了分析，具体结果如下： （1）本文对大丽轮枝菌 V- 190 遗传转化的关键条件、因素和参数进行了摸索和优 化，确定了最适筛选转化子的潮霉素浓度为 50g/mL，头孢噻肟钠与羧卞青霉素对农杆 菌有效抑制的浓度为 200/200g/mL。确定了共培养最佳方式是将萌发的大丽轮枝菌分 生
3、孢子与农杆菌混合物 25共培养于 Fries 培养基中，共培养的最佳时间为 2d，从接种 病斑上分离并萌发的分生孢子作为转化受体的转化效率最高。应用最适的转化条件，最 终平均获得 2030 个转化子/105分生孢子。 （2）实验对所得的部分转化子进行了 PCR 验证。根据 T- DNA 上已知潮霉素基因 序列设计引物进行 PCR，检测结果发现所检测的转化子均含有目的潮霉素基因片段。 （3）将所获得的转化子接种于 PDA 培养基上，25培养 710d，观察其菌落形态 和显微特征， 获得了 7 株菌落形态发生变异的突变体 （T- 22, T- 23, T- 42, T- 13, T- 212, T
4、- 36, T- 215） 、1 株生长速度减慢致病力降低的突变体（T- 22） ，未发现孢子形态发生变化的突 变体。 关键词：棉花黄萎病菌；大丽轮枝菌 V- 190；T- DNA；农杆菌介导；突变 6 Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Verticillium dahliae kleb. Master candidate：Hanshao- hui Major：Biochemistry and molecular biology Supervisor：Zhubao- cheng Abstract Vercicillium
5、wilt disease of cotton, caused by Vercicillium dahilae, is an important disease of carton has resulted in destructive economic damage in most carton- growing areas of the world. Nowadays, the direct method to find the function of the genes involved in pathogenicity, is to construct the mutants which
6、 destruct this pathological gene and the further observation is to find the change of the phenotype of the the transformants, then calculating the function of the gene. The technique of the Agrobacterium tumefaciens- mediated transformation (ATMT) has become a useful tool for studying the interactio
7、n between fungi and their hosts by its special advantage. In this thesis, a transformation system of Vercicillium dahilae mediated by ATMT had been established and some transformants characters had been analyzed. The research contents were showed as follows: (1) The key conditions, factors and param
8、eters of the transformation system in Vercicillium dahilae were screened and optimized. We made sure that the most suitable concentration of hygromycin B for screening the mutants was 50g/mL and the effect concentration of cefataxime and carbenicillin inhibiting Agrobacerium tumefaciens growth was 2
9、00/200g/mL. In addition, the way of co- cultivation was that the conidia of Vercicillium dahilae and Agrobacterium tumefaciens were cultured in the Fries medium under 25, the most suitable time of co- cultivation was 2d, and took the germ spores apart from the lesion which was the best for the trans
10、formation. Using this optimized transformation system, we obtained about 20- 30 transformants of Vercicillium dahilae from 1105 spores. (2) Part of transformants were validated by PCR amplification. The primers were designed by the sequence of hph gene which we have known. The results showed that al
11、 the transformants we gained contained the target hph fragment. (3) The transformants we obtained were inoculated in the PDA medium, under the 25 for 7- 10d, then the transformants whose colonial and microscopical morphology diversified markedly from the parental strain were screened from the transf
12、ormants, the results showed that 7 mutants(T- 22, T- 23, T- 42, T- 13, T- 212, T- 36, T- 215) were found mutated in colonial morphology, 1 mutant(T- 22) in slowgrowth rate and pathogenicity reduced, none in conidium morphology changed. Key words: Vercicillium dahilaeV- 190; T- DNA; agrobacterium tum
13、efaciens- mediated transformation; mutant. 4 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果， 也不包含为获得 河北农业大学河北农业大学 或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 签字日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 河北农业大学河北农业大学 有关保留、使用学位论文的规定，有 权保
14、留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本 人授权河北农业大学河北农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 （保密的学位论文在解密后适用本授权书） 学位论文作者签名： 导师签名： 签字日期： 年 月 日 签字日期： 年 月 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 电 话： 通讯地址： 邮 编： 河北农业大学硕士学位（毕业）论文 2 1 前言 1.1 棉花黄萎病概述 棉花黄萎病(Verticillium wilt)是世界性的危险病害，是一种危害极大的维管束系统 病害1。棉花黄萎病菌分布
15、广、危害重、寄主范围广、传播途径多、存活时间久，是棉 花生长过程中最具毁灭性的病害之一。 自 1914 年 Carpenter 在美国弗吉尼亚州的陆地棉上发现该病害以来， 目前已遍布美 国、中国、俄罗斯、印度等世界棉花主产区1。当前，全球每年因黄萎病害所造成的经 济损失平均十亿多美元2。 我国棉花黄萎病是 1935 年由美国引进斯字棉品种 4B 时伴随种子传入。从 20 世纪 70 年代起，我国棉花黄萎病呈发展和蔓延的趋势，先后在陕西径阳、山西运城、山东 高密和河南安阳等地发生危害，到 20 世纪 80 年代末，我国棉花黄萎病分布已遍及 18 个省市、自治区、478 个县市。1993 年棉花黄
16、萎病在我国大发生，北方棉区重病棉田棉 花病株率达80%， 当年全国黄萎病发病面积为266. 67万公顷， 损失皮棉约1亿Kg， 2002、 2003 年在黄河流域和新疆棉区再次爆发。棉花黄萎病已成为影响我国棉花高产稳产的 主要障碍，极大地影响了棉花的生产3。 1.2 棉花黄萎病菌研究进展 1.2.1 棉花黄萎病菌的鉴定及形态学特征 黄萎病菌的寄主范围极为广泛，早期报道的寄主植物达 660 种，在农作物中除了侵 染棉花之外，常见的侵染寄主还有西红柿、土豆、茄子、花生、橄榄等，但是一般不侵 染禾本科的植物4。 棉花黄萎病菌在分类上属半知菌亚门(Deuteromycotina)、丝孢菌纲(Hyphomyc- etes)、丝胞目(Hyphomycetales)、淡色孢科(Moni1iaceae)、轮枝孢菌属(Verticillium)5。 此属包含若干个“种”：黑白轮枝菌(Verticilliu
