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1、华中科技大学 博士学位论文 内质网应激反应（ERS）参与强噪声诱导豚鼠耳蜗细胞凋亡的实 验研究 姓名：薛秋红 申请学位级别：博士 专业：耳鼻咽喉科学 指导教师：龚树生 20070501 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 III 内质网应激反应（ERS）参与强噪声诱导豚鼠 耳蜗细胞凋亡的实验研究 内质网应激反应（ERS）参与强噪声诱导豚鼠 耳蜗细胞凋亡的实验研究 华中科技大学同济医学院附属协和医院耳鼻咽喉科学 博士研究生：薛秋红 导 师：龚树生 教授 中文摘要 中文摘要 细胞凋亡是一个复杂的病理生理过程， 其过程归纳为两条途径： 一是
2、细胞外途径， 即死亡受体途径。细胞外死亡信号蛋白与其受体结合，以激活Caspase8为特征。二 是细胞内途径，研究比较多是线粒体途径。通透性改变的线粒体，释放细胞色素C， 激活Caspase9为特征。近年来研究表明内质网（endoplasmic reticulum, ER）可能是 细胞内诱导凋亡的一个新场所， 因此提出内质网应激反应性凋亡通道。 最近研究表明， 细胞凋亡也是强噪声暴露诱导耳蜗细胞死亡的一种方式。本课题通过用中心频率4kHz 的窄带噪声、给声强度120dB SPL、暴露时间4h的噪声刺激建立豚鼠噪声性耳聋 （noise-induced hearing loss,NIHL）的动物模
3、型，探讨噪声性耳聋是否存在细胞凋亡， 以及内质网应激反应（endoplasmic reticulum stress,ERS）是否参与了强噪声诱导耳 蜗细胞凋亡以及其调控机制的研究,为进一步阐明噪声性耳聋的发病机制奠定基础， 为将来治疗噪声性耳聋提供新的思路。本文共分为三个部分。 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 IV 第一部分 噪声性耳聋动物模型的建立 第一部分 噪声性耳聋动物模型的建立 目的目的 建立噪声性耳聋的动物模型，为下一步研究噪声性耳聋过程中是否存在 细胞凋亡奠定基础。 方法 方法 选用雄性白色豚鼠80只，随机分为实验组6
4、0只，对照组20只。实验组用 中心频率4kHz的窄带噪声，给声强度为120dB SPL,噪声暴露时间为4h的噪声条件进行 声暴露。健康对照组不接触噪声。分别在噪声暴露前及噪声暴露后1、4和14d后测动 物ABR阈值。 结果结果 以波作为判断ABR阈值的指征。噪声暴露后1d、4d、14d组ABR平均阈值 分别为90.003.33dB，64.506.85dB，60.006.67dB，对照组ABR平均阈值33.00 5.38dB。统计学分析各组之间差异有统计学意义（P0.05；* *表示各组与噪声暴露前相 比差异有高度显著性*P0.01； 表示噪声暴露后1d与4d、14d相比差异有高度显著性P0.0
5、1。 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 7 噪声暴露前后ABR阈值变化 * * * 0 20 40 60 80 100 Ctrl1d4d14d 时间 ABR阈值 噪声暴露前 噪声暴露后 图 1：图 1：各组豚鼠噪声暴露前后 ABR波反应阈值变化 （ * *表示各组与噪声暴露前相比差异有高度显著性*P0.01，表示噪声暴露后 1d 与 4d、 14d 相比差异有高度显著性 P0.01 ） 3 讨论 3 讨论 噪声对听觉系统有特异性的损害作用。噪声性聋的发病因素错综复杂，如与噪声 的强度、特性、频谱、作用时间、个体差异等有关，各因素又相
6、互关联、相互影响。 强噪声可损害耳蜗内的微循环，导致耳蜗缺血、缺氧造成毛细胞和螺旋神经节的退行 性变。噪声性耳聋是由于噪声刺激后相继引起耳蜗毛细胞、毛细胞/传入神经突触、 螺旋神经节细胞相继病变和死亡，形成的一种感音性失听。 随着社会的发展，环境 和工业噪声对人们身心健康的危害越来越大，噪声性耳聋是噪声引起的最常见疾病之 一， 其发病率有逐年增高的趋势， 据资料统计噪声性耳聋占临床听力损失的5-7% 【1】【1】 ， 占特殊职业人群的30-70% 【2】【2】 ，已被认为是世界性七大公害之一，为全社会所关注。噪 声对于听觉中枢与听觉末梢均有损伤，而首当其冲受到损伤的是听觉末梢(耳蜗)，其 发病
7、机制复杂多样，主要集中于 1.微循环学说 2.神经递质和受体学说 3.Ca 2+超载学 说 4.氧自由基学说。但目前对其致伤环节与机制尚未完全弄清楚，防治问题尚未完 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 8 全解决。因此，深入研究噪声性耳蜗损伤的损伤环节及其发生机制仍然具有十分重要 的意义。 以往研究表明，与人类听觉特性较为接近的实验动物主要包括豚鼠、小鼠或大鼠 等。由于豚鼠内耳的解剖生理特性与人类的相似，其内耳频响特性与人内耳也比较一 致，豚鼠听神经对声波特别是 7002000Hz 的纯音最敏感，并且豚鼠的耳蜗突出于中 耳腔内，较易完
8、成内耳的取材，能为后续实验提供合适的样本，因此豚鼠可能是感音 神经性耳聋动物模型最理想的实验动物,而且经过几十年的研究和积累,建立了一套 比较成熟的动物模型及疗效评价方法(如耳蜗铺片、染色、电镜观察及 ABR 检测等)， 常用于听觉和内耳疾病的研究。 如噪声对听力的影响， 药物对听神经的影响等研究 【3】【3】 。 因此我们选择豚鼠作为我们的试验研究对象。 建立合适的动物噪声听觉损伤模型可以通过在实验中精确控制噪声暴露量来进 行。噪声性听力损失分为暂时性听觉阈移（TTS）和永久性听觉阈移（PTS） 。暂时性 听觉阈移是指由于短时间内接触强噪声,主观感觉听力下降,检查可发现听阈提高 1030dB
9、,但听阈可在短时间内恢复到原来水平；永久性听觉阈移是指由于长时间接 触强噪声,听力下降呈永久性,其特点（1）阈移值一般超过 35dB； （2）阈移存在时间 超过 3-7 天 ； （3）阈移的发生频率为高、中、低频；永久性阈移的病理基础是耳蜗 Corti 氏器,特别是毛细胞发生了不可逆的病理改变 【4】【4】 。 由于暂时性听觉阈移可自动恢 复,在进行噪声性听力损失机制或有关防护措施研究时,某种噪声暴露模型若仅引起 暂时性阈移则在进行听功能评价时缺乏说服力,理想的噪声暴露模型应能产生 一定的永久性阈移和一定的病理损伤,因此,噪声暴露模型也可理解为听力损失模 型。人们一般采取短期强噪声暴露来建立噪
10、声性耳聋模型。研究表明,豚鼠接触 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 9 4kHzOBN、 115B()噪声连续 5 【5】【5】,栗鼠接触白噪声 95dB SPL 噪声连续暴露 6h【6】, 灰鼠接触 4kHzOBN、105dB SPL 噪声连续 6 【7】,大鼠接触 100Hz20kHz 宽频带 90dB SPL 噪声连续 60 【8】,灰鼠连续接触强度为 150dB SPL 的脉冲噪声 100 次【9】等噪声 暴露模型均引起了实验动物一定程度的永久性听觉阈移。所以我们选择噪声频率为中 心频率 4kHz 的窄带噪声,声强度为 12
11、0dB SPL,连续暴露时间为 4h 作为我们噪声暴露 试验条件。 一般采用听性脑干反应（ABR） 、畸变产物耳声发射（DPOAE）等客观功能测听方 法来评价动物模型的成功建立与否。ABR 是反映听功能的一项客观指标。ABR 测试为 非侵入性测听手段，对内耳不产生影响，能客观反应听阈变化 【10】【10】。豚鼠的 ABR 主要 出现波、，各波均有一个主要发生源，波起源于第颅神经、波起 源于耳蜗核、波为上橄榄核、波为外侧丘系。豚鼠一般以 ABR 的波来判定其听 觉反应阈值。 本实验中，噪声刺激停止后1d、4d、14d的ABR平均阈值分别为 90.003.33dB， 64.506.85dB，60.
12、006.67dB，对照组ABR平均阈值33.005.38dB。统计学分析 实验组明显高于噪声暴露前及对照组的平均阈值（P001）,而 1d组ABR平均阈值均 明显高于4d、14d组，差异有统计学意义（P0.05） ，根据永久性阈移（PTS）的特点，说明噪声暴露后第4天所测得 的ABR阈移为永久性阈移。该结果说明,本实验噪声暴露刺激条件可对豚鼠耳蜗的听功 能产生损伤。而对照组听功能变化仅在0-5dB，表明本实验制造豚鼠噪声性耳聋的造 模是成功的。该噪声暴露豚鼠模型能满足下一步研究噪声性耳聋损害耳蜗过程中是否 存在细胞凋亡的实验。 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大
13、 学 博 士 学 位 论 文 10 4 小结 4 小结 噪声刺激后1d、 4d、 14d豚鼠均有听力下降, ABR平均阈值分别为 90.003.33dB， 64.506.85dB，60.006.67dB，分别与噪声暴露前相比差异均有显著性（P0.01）, 1d 与 4d、14d 组差异有统计学意义（P0.05） 。说明本噪声刺激可以引起豚鼠永久性听觉阈值位移（PTS） ，本实验噪声 性耳聋动物模型的建立是成功的。 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 11 参考文献 参考文献 1 Ward WD, Santi PA, Duvall AJ
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