植物病原细菌学实验分析

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1、植物病原细菌学实验 实验一 植物病原细菌常用培养基 的制作与灭菌 1.了解细菌培养基的种类； 2.掌握常用细菌培养基的配方和制作方法； 3.掌握培养基的灭菌方法。 一、实验目的 二、实验内容和操作方法 （1）配方：牛肉膏3，蛋白胨 10，NaCl 5，琼 脂 20，蒸馏水 1000 L。 1.牛肉膏蛋白胨培养基(NA)：分离和培养最常用 （2）配制过程：将牛肉膏、蛋白胨、 NaCl 溶于蒸馏 水后，调节pH7.2，加入琼脂溶化后分装于三角瓶和 试管。 （一）培养基的配制 2. Hugh和Leifson（HL）培养基：细菌的好氧性和厌 氧性测定 蛋白胨 2.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钾

2、 0.2 g 琼脂 3.0 g 蒸馏水 1000.0 ml pH 7.47.8 溴百里酚兰（1.6酒精溶液 1.5 ml） 待培养基融化，并调pH后，装于试管中，每支试管装9 ml 灭菌。培养基凝固后，用接种针蘸细菌悬浮液针刺 接种，一直刺到管底。分别在培养2、4和7 d后观察记 录。 好氧性细菌，只在开管的上部生长；兼性厌氧性细菌 ，则在开管的上下部都能生长；厌氧性细菌，则只能在 开管的下部和闭管中生长。 （1）配方：NH4H2PO41.0，氯化钾0.2， MgSO4.7H2O 0.2，蒸馏水1000 L，溴百里酚兰（ 1.6%酒精溶液）1.5 mL; 1%碳素化合物。 3.Ayers培养基

3、：碳素化合物产酸试验 单糖（葡萄糖、半乳糖）；双糖（麦芽糖、乳糖） ；多糖（淀粉）；醇（甘露醇）。 有的细菌不产酸和气，有的只产酸不产气，少数植 物病原细菌既产酸又产气 （3）分装：将上述培养基分装于试管中，每管10 mL左右。如果测定气体产生，加上杜氏发酵小玻管 后灭菌。 产酸时培养液变黄，产碱时变蓝，产气则小玻管内 培养液被部分排出，出现空隙。 （2）配制过程：将NH4H2PO4、氯化钾、 MgSO4.7H2O溶于蒸馏水，调节pH7.0后加入溴百里 酚兰，最后加入碳素化合物（也可分别灭菌后加入） 4. MR和VP试验：对葡萄糖的分解能力 （1）配方：蛋白胨5，葡萄糖5，磷酸氢 二钾5，蒸馏

4、水 1000 L。 （2）配制过程：将蛋白胨、葡萄糖、磷酸氢 二钾溶于蒸馏水，调节 pH7.0-7.2，每管分装 5mL即可。 5. 硝酸盐还原 （1）配方：硝酸钾1.0，蛋白胨5.0，酵母 膏3.0，蒸馏水1000L， pH7.0-7.2 （2）配制过程：将硝酸钾、蛋白胨、酵母膏 称好后，溶解于蒸馏水后，调节 pH。 6. 半胱氨酸培养液：测定产H2S能力 （1）配方：蛋白胨10，硫酸钠0.1g，半胱氨 酸0.1g，蒸馏水1000L。 （2）配制过程：将半胱氨酸、蛋白胨、硫酸 钠称好后，溶解于水中，调节 pH7.0-7.3即可。 7. 吲哚试验 （1）配方： 蛋白胨20.0，磷酸氢二钠2.0

5、g， 葡萄糖10.0g，蒸馏水1000L。 （2）配制过程：将蛋白胨等称好后，溶解于 蒸馏水，调节pH7.0-7.2即可。 8. 明胶液化 （1）配方： 牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0，明 胶10-12%，蒸馏水1000L。 （2）配制过程：将牛肉浸膏、蛋白胨溶解于 蒸馏水中，调节pH7.0-7.2后，将明胶溶解于此 溶液中，即可分装于试管中。 9. 淀粉水解试验 （1）配方： 牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨17.5， 淀粉1.5 g，琼脂15-20 g，蒸馏水1000 L。 （2）配制过程：将牛肉浸膏、蛋白胨、淀粉 称好后，溶解于蒸馏水中，加入称好的琼脂， 待融化后调节pH7.0-7.2。 10

6、. 石蕊牛乳反应 （1）配方： 脱脂牛乳1000 L ， 石蕊液（4%）15-20 mL。 （2）配制过程：提前配制石蕊液 （二）培养基的灭菌 上述培养基应按培养基配方中规定的条件及时进 行灭菌。普通培养基为1212030min，以保证 灭菌效果和不损伤培养基的有效成份。培养基经灭 菌后，如需要作斜面固体培养基，则灭菌后立即摆 放成斜面，斜面长度一般以不超过试管长度的1/2 为宜；半固体培养基灭菌后，垂直冷凝成半固体深 层琼脂。 明胶培养基灭菌12-15分钟。 石蕊牛乳培养基间歇灭菌3次，每次通蒸汽20-30 分钟。 灭菌方法 灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生 物，灭菌的方法分物理和化学

7、灭菌法两大类。 本实验主要介绍物理方法的一种，即加热灭菌。 加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。 通过加热使菌体内蛋白质凝固变性，从而达到杀 菌目的。 高压蒸汽灭菌法 高压蒸汽灭菌用途广，效率高，是基于水的沸 点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。 当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时，水蒸气的温度升高 到121，经2030min，可全部杀死锅内物品上 的各种微生物和它们的孢子或芽孢。 一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等 都可应用此法灭菌。 操作方法和注意事项如下: 加水 打开灭菌锅盖，向锅内加水到水位线。注意水要 加够，防止灭菌过程中干锅。 装料、加盖 灭菌材料放好后，关闭灭菌器盖，

8、采用对角式 均匀拧紧锅盖上的螺旋，使蒸汽锅密闭，勿使漏气 。 排气 打开放气阀。用电炉加热，待水煮沸后，水蒸 气和空气一起从排气孔排出，当有大量蒸汽排出时 ，维持5min，使锅内冷空气完全排净。 升压、保压和降压 当锅内冷空气排净时，即可关闭排气阀，压力开 始上升。当压力上升至所需压力时，控制电压以维 持恒温，并开始计算灭菌时间，待时间达到要求（ 一般培养基和器皿灭菌控制在121，20min）后 ，停止加热，待压力降至接近“0”时，打开放气阀。 注意不能过早过急地排气，否则会由于瓶内压力下 降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外。 干热灭菌法 通过使用干热空气杀灭微生物的方法叫干热灭 菌。

9、一般是把待灭菌的物品包装就绪后，放入电烘 箱中烘烤，即加热至160170维持12h。 干热灭菌法常用于空玻璃器皿、金属器具的灭菌。 凡带有胶皮的物品，液体及固体培养基等都不能用 此法灭菌。 1 细菌（NA）和真菌(PDA)常用培养基的配方和制 作过程有何异同点？ 2 试述高压蒸汽灭菌的操作方法和注意事项。 三、作业 实验二 植物病原细菌的分离 和致病性测定 二、实验内容和操作方法 （1）首先要选择典型、新鲜病组织; （2）以灭菌剪将病斑剪下，略带健康组织， 大小约0.51公分左右，放在灭菌载玻片中央 ，加无菌水1d。加上灭菌盖玻片，静置约 10min左右，观察是否有云雾状自破口处涌出 （一）细

10、菌溢现象观察 （1）斑点型：如棉花角斑病。 A. 剪取新鲜的典型病斑，约1cm见方。 （二）植物病原细菌的分离 1. 细菌悬浮液的配制（不同症状类型分离材 料的选择和表面消毒） B.表面消毒：将切取的组织块在70乙醇中 浸一下立即取出，然后用表面消毒剂进行表面 消毒，可以采用0.1升汞，152min或0.5 的次亚氯酸盐如漂白粉（1：9稀释液）2min C.消毒后用灭菌水洗涤3次，将病组织放在 另一个培养皿的灭菌水中，剪破中心或以灭菌 玻璃棒研碎病组织静置2030分钟，等细菌游 出。 （2）萎蔫型如茄青枯病 将茎部剪成12寸长，表面用70酒精轻拭 ，在火焰上表面消毒，以灭菌刀纵剖，选择轻 微变

11、色病部，以灭菌刀切出薄片或以解剖针挑 出病健交界处组织（可以不再消毒），加灭菌 水浸泡20-30分钟。 如果茎部较粗，也可以在表面消毒后用解剖 刀横断茎部，用夹子或手紧压茎部横断面，挤 出溢脓或汁液。 （3）肿瘤组织 软瘤比较容易分离；木质瘤可以磨碎后接 种在向日葵、番茄等幼株上长出瘤后再分离。 由于细菌位于表皮细胞和木质部之间，因 此应用酒精棉花擦拭表面，在火焰上表面消毒 ，再在灭菌皿中实行解剖后以灭菌玻棒将其捣 碎，静置浸泡24h。 （4）腐烂组织 较简单，选择近病部交界处以接种环挑取少 量腐烂组织，稀释。 （5）种子带菌的分离 选择病种子，以0.1升汞液表面消毒1 2min，灭菌水洗涤，

12、再将此种子在70酒精中 浸几分钟，洗涤23次，取出放在研钵中磨碎 ，离心取上清液。 2. 分离方法 A.倒平板：注意培养基的温度不能太高，否 则冷凝水太多，细菌在水中游动而影响单个分 散菌落的形成。 （1）平板划线分离法：被普遍采用 B.用接种环蘸取上述配制好的菌悬液，在已凝 固的平板培养基表面划线 如果菌液浓度大，培养皿 转动角度减小，增加划线 的次数 划4条线后，将接种环灭菌 ，培养皿转动90，从第2 条线开始划45条线 （2）培养皿稀释分离法 0 原液 1 取1环菌液 0.5L灭菌水 2 混匀后取1环 3 混匀后取1环 4 混匀后取1环 5 混匀后取1环 3.培养 一般放置在 2830温

13、箱中倒置培养，时 间23 d。 将冷却至45左右的培养基倒入装有稀释 菌液的培养皿中，轻轻转动培养皿，使菌液和 培养基混匀，待其凝固后培养。 4.细菌的纯化 挑取分离出的典型单菌落平板划线培养（2 皿），如此重复12次，最后，在均匀一致的 平板中，挑取典型菌落移植在斜面培养基上培 养，长成后在4环境中保存菌种。 1. 配制107-108CFU/mL的细菌悬浮液，菌龄48 小时左右； （二）致病性测定 2. 指示植物的选择：一般用烟草，在假单胞和 黄单胞菌属上较适用。 3. 接种方法：用注射器将细菌液从烟草下表皮 注入叶肉细胞间。用灭菌水作阴性对照，同属 HR阳性的菌株作阳性对照。 4. 培养条

14、件：接种后的植物应保持在25，相 对湿度较高（85%）的条件下。 5. 结果观察：在2448h表现枯斑为阳性反应 ，3d左右出现黄斑为阴性反应。 三 作业： 1.简述本实验中植物病原细菌的分离步骤及其操作注 意事项 2. 烟草过敏性反应试验能够确定细菌的致病性吗？为 什么？ 实验三 植物病原细菌的形态观察 1.了解革兰氏染色鉴定的快速鉴定方法； 2.掌握革兰氏染色和鞭毛染色的方法； 3.掌握细菌培养性状的描述特征。 一、实验目的 二、实验内容和操作方法 1.结晶紫草酸铵染色 （一）革兰氏染色 （1）试剂 A. 结晶紫草酸铵染剂： 溶液：结晶紫2.0g，酒精（95%）20mL 混合溶液和，过滤，

15、贮藏于试剂瓶中，24h后 使用。 溶液：草酸铵0.8g，蒸馏水80mL C.复染剂 原液：番红O 2.5g，95%酒精100mL 复染剂：原液10mL，蒸馏水90mL B. 鲁戈尔碘液：碘1.0g，碘化钾2g蒸馏水300mL。 将碘和碘化钾在研钵中研和，慢慢加水并继续研 和直至碘和碘化钾溶解，然后加水稀释到300mL，盛 入棕色试剂瓶，放暗处备用。 （2）染色程序 A. 配制细菌悬浮液：菌龄16h B. 在干净的载玻片上涂片、风干，不要加热，然后在 火焰上通过2次，固定玻片。 C. 结晶紫染色1分钟，水洗数秒钟，吸干。 D. 碘液处理1分钟，水洗，吸干。 E. 用95%酒精褪色约30秒。水洗，

16、吸干 F. 番红O复染10秒，水洗，吸干 G. 加1滴香柏油，在油镜下镜检，红色为革兰氏阴性 菌，紫色为革兰氏阳性菌。 2. 氢氧化钾溶解试验 （1）试剂：3氢氧化钾 （2）方法：取12滴3氢氧化钾溶液置于干净的 玻片上，用牙签取新鲜细菌培养物与氢氧化钾混合， 充分搅拌1020秒，如果液滴变粘稠并可拉出丝状物 体，表示测试菌为革兰氏阴性菌，反之则为革兰氏阳 性菌。 1.试剂 （二）鞭毛染色（西萨基尔法） （1）媒染剂：单宁酸10g，ALCL3.6H2O 18g， ZnCL2 10g，碱性品红1.5g，60%酒精40mL 在研钵中加入酒精和上述各种成分，充分研磨后， 再加入其余的酒精。使用前用蒸馏水稀释2倍，染色时 过滤，滤液直接滴在涂片上。 溶液：碱性品红0.3g，酒精（95%）10mL 溶液和分别配制后混合。 溶液：苯酚（结晶）5g，蒸馏水95mL （2）染液： 2. 染色步骤 （1）载玻片准备：选用新的或没有