土拨鼠ctla4+的原核表达和多克隆抗体的制备

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1、华中科技大学硕士学位论文土拨鼠CTLA4 的原核表达和多克隆抗体的制备姓名：陈尊义申请学位级别：硕士专业：病原生物学指导教师：陆蒙吉20090501 华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 1 土拨鼠 CTLA4 的原核表达和多克隆抗体的制备硕士研究生陈尊义导师陆蒙吉教授华中科技大学同济医学院病原生物系微生物教研室中文摘要研究背景：土拨鼠肝炎病毒（Woodchuck hepatitis virus，WHV）属于嗜肝DNA病毒，与人乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）关系十分密

2、切，在基因组结构、病毒复制和病毒感染过程等方面都十分的相类似1,2,3，是目前已知的用于研究乙肝病毒的致病机制和筛选新的抗病毒药物，并且在研制新的疫苗中发挥重要作用的最理想小动物模型。目前各国学者对乙型肝炎病毒难以清除，如果机体缺乏有效的T细胞免疫会最终导致慢性化这一点是持一致和肯定意见的。注重于探讨抗病毒反应引起T细胞活化的相关因素在以往的研究中多有涉及，但是却忽略了一个目前已经逐渐认识到了的重要问题：负调节机制在抑制T细胞活化方面同样发挥重要作用。近年来的许多研究表明乙肝感染程度除了与免疫反应的强度有关之外，它同时又是一个被许多细胞因子相互调节的过程，这其中就包括细胞表面的受体CTLA

3、44。在本研究中，通过分子克隆的手段成功将 CTLA4 构建到原核表达载体中并在大肠杆菌 BL21（DE3）进行诱导表达，并最终制备了多克隆抗体。这一实验结果为进一步完善土拨鼠模型相关指标，检测和研究 CTLA4 在正常、急性、慢性WHV 中的表达，评估 CTLA4 在肝炎慢性化中的作用奠定一定的基础。华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 2目的 1. 构建土拨鼠 CTLA4 的原核表达载体并在大肠杆菌中进行表达。 2. 制备了多克隆抗体，同时检测土拨鼠 CTLA4 的特异性和灵敏性。方法 1. 应用基

4、因工程技术将土拨鼠的CTLA4的基因片段装入原核表达载体，转化表达菌后诱导目的蛋白的表达，应用电洗脱方法纯化目的蛋白，并用SDS-PAGE和Western blot对表达产物（目的蛋白）进行相应鉴定。 2. 用纯化的目的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体，并纯化多克隆抗体。结果 1. 通过 PCR 鉴定、酶切鉴定,并在核酸测序后与 CTLA4 的原始序列比对，结果表明成功构建土拨鼠 CTLA4 的原核表达载体。 2. 用目的蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体，采用酶联免疫吸附实验（ELISA），Western blot 等方法对多克隆抗体的灵敏度和特异性进行检测。关键词土拨

5、鼠乙型肝炎原核表达多克隆抗体华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 3Construction of prokaryotic expressionvector of CTLA4 in woodchuck and polyclonal antibody production Candidate: Chen zunyi Supervisor： Prof. Mengji Lu Division of Microbiology, Department of Pathogenic Biology, Tongji Me

6、dical College, Huazhong University of Science and technology, Wuhan, China Abstract Background Woodchuck hepatitis virus(WHV) is closely to HBV, having higher similarities in morphology, genome structure and gene products ,replication, epidemiology, and the course of infection. So the woodchuck is a

7、n very important animal model to investigate the pathogenesis of hepatitis B virus (HBV) infection in humans. Most research aimed at understanding the mechanisms underlying recovery from HBV infection has been focused on the factors that lead to the activation of antiviral T-cell responses. In fact,

8、 the outcome of HBV infection varies according to the vigor of the immune response, a process that is also regulated by a number of molecules, including the cell surface receptor CTLA-4, which is an inhibitory receptor expressed by T lymphocytes that acts largely as a negative regulator of T-cell re

9、sponses. 华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 4Objective 1. to construct a prokaryotic plasmid expressing of CTLA4 in woodchuck 2purify the recombinant protein, and to develop polyclonal antibodies Methods 1. DNA fragment coding CTLA4 was cloned into PGTK-2XF vector using gene

10、 engineering technique 2. Recombinant plasmid was transformed into host strain BL21 and then protein expression was induced 3. Recombinant protein was purified by electroeluting 4. Polyclonal antibodies were developed by immunizing rabbits with purified recombinant protein ,，and the sensitivity and

11、specificity were tested by EL ISA , immunofluorescence and Western blot assays Results 1. CTLA4 was cloned into vector PGTK-2XF ，then expressed in E. coli Induced by IPTG，the recombinant protein was purified using electroeluting 2. polyclonal antibody was developed by immunizing rabbit with the reco

12、mbinant protein Key words Woodchuck；HBV；prokaryotic expression vector；polyclonal antibody 中英文缩写名词对照表英文缩写英文全称中文 WHV Woodchuck hepatitis virus 土拨鼠肝炎病毒 HBV Hepatitis B virus 乙型肝炎病毒 DMSO Dimethyl sulfoxide 二甲亚砜 EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸 IPTG Isopropyl -D-1-Thiogalactopyranoside 异丙

13、基-D-硫代半乳糖苷 HRP Horseradish peroxidase 辣根过氧化物酶 PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链反应 ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附实验独创性声明独创性声明独创性声明独创性声明本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做

14、出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。学位论文作者签名：日期：2009 年 05 月 08 日学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密，在_年解密后适用本授权书。本论文属于不保密。（请在以上方框

15、内打“” ）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：2009 年 05 月 08 日日期：2009 年 05 月 08 日华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 5 土拨鼠 CTLA4 的原核表达和多克隆抗体的制备硕士研究生陈尊义导师陆蒙吉教授华中科技大学同济医学院病原生物系微生物教研室引言乙型肝炎被认为是重要的传染病，不但降低人们的生活质量，而且危害人类的生命健康。乙肝病毒（Hepatitis B Virus，HBV）是引起肝脏疾病的主要病因之一，全世界有超过 3.5 亿左右的慢性乙

16、肝病毒感染者，其中中国大概就有 1.2 亿的乙肝感染者，约占 34。乙肝患者除了一部分使用抗病毒药物被治愈，或者由于自身抗体的产生而自愈外，还有相当一部分患者发展为慢性乙肝，甚至进展为肝硬化、肝癌等1,2。乙型肝炎的慢性化、病毒难以清除与机体缺乏有效的 T 细胞免疫应答有关。目前已知 T 细胞的活化有赖于两个来自细胞外的信号刺激，即我们熟知的 T 淋巴细胞活化过程中需要的双信号和细胞因子的作用。T 细胞活化的第一信号主要来自 T 细胞抗原识别受体(TCR) 与 MHC 分子抗原肽复合物的特异性结合。T 细胞活化的第二信号是由抗原递呈细胞(APC) 和 T 细胞表面的粘附分子对提供，又称为共刺

17、激信号，这些粘附分子也被称为共刺激分子。目前已经知道，在细胞免疫反应中，有多种共刺激分子参与免疫过程的信息传递，其中最重要的是 T 细胞表面的CD28/CTLA-4 以及 APC 表面的相应配体 B7 (包括 B7-1/B7-2) 3。以往对乙型肝炎的研究大多注重于对 T 细胞免疫应答正调节的研究，却忽略了CTLA-4、PD1、IL-10 等负调节因子在抑制和调节 T 细胞免疫应答中发挥的华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 6重要作用。 1987 年Brunet等学者发现了CTLA-4 基因4，目前我们把

18、CTLA-4 称为细胞毒性T 淋巴细胞相关抗原4 (cytolytic T lymphocyte associated antigen 4)。近二十多年来，由于对CTLA-4发挥作用的认识相对不足，目前对CTLA-4功能的了解也是仍然十分有限。通过比对人CTLA-4 基因及人的CD28基因可以发现它们之间的同源性很高，但它们在表达上却有明显的不同： CD28 可以表达于所有的T 细胞表面，而CTLA4 仅在活化的CD8+ T 细胞表面表达，在静息的T 细胞中仅弱表达或者根本不表达 5。近年来对CTLA-4的研究显示它可以提高T细胞的动员能力，提高CTLA-4的表达量可以使CTLA-4与CD28

19、竞争性结合受体，阻碍细胞迁移。CTLA-4还能够通过限制细胞间接触的方式减少细胞的增殖和细胞因子（特别是IL-2）的产生，从而抑制受体的表达，以及控制细胞周期的发展，使得细胞周期停滞在G1期，不向S期发展，从而达到调节的作用6-9 通过收集慢性HBV感染者的血液标本并分离外周血单个核细胞（PBMC），对患者CTLA4基因多态性进行相关的研究，结果也证实CTLA4外显子49位等位基因的多态性可能在乙型肝炎病毒感染慢性化过程中发挥作用10。最近的研究还表明，CTLA-4的负调节作用有利于机体免疫系统的激活，从而促进清除乙肝病毒 11。土拨鼠肝炎病毒（Woodchuck hepatitis vi

20、rus， WHV）与人乙型肝炎病毒(HBV)基因遗传背景上高度同源，是目前已知的研究 HBV 感染的重要动物模型。为了进一步完善该动物模型，本研究构建了土拨鼠 CTLA4 的原核表达质粒，并诱导表达目的蛋白，通过电洗脱法纯化获得高纯度目的蛋白，评价了目的蛋白的抗原性。还通过纯化的目的蛋白免疫动物获得多克隆抗体，为进一步研究土拨鼠模型 CTLA4 的生物学功能，检测 CTLA4 在正常、急性、慢性WHV 中的表达，评估 CTLA4 在肝炎慢性化等方面的作用提供了一个重要的实验材料。华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文

21、文文文 7 材料与方法 1.材料 1.1 经过改建的质粒载体 PGTK-2XF 由美籍华人冯新华教授赠送，感受态细胞DH5、BL21（DE3）为本实验室保存。 1.2 主要仪器和设备普通台式离心机北京六一仪器厂台式高速低温离心机美国 Sigma 公司 PCR 扩增仪美国 Bio-rad 恒压恒流电泳仪北京六一仪器厂台式水平振荡器上海分析仪器厂紫外透射反射分析仪美国 Gene 公司超净工作台苏州净化设备公司倒置荧光显微镜 Nikon TE2000-U 倒置荧光显微镜成像系统 Penguin 150CL 凝胶成像分析系统美国 Gene 公司 70冰箱 Thermo 公司

22、 40冰箱日本三洋公司水浴恒温箱江苏太仓器材厂超声处理仪美国 Contes 公司电洗脱仪北京六一仪器厂 DNA/RNA 定量分析仪 Thermo 公司恒温摇床江苏太仓器材厂华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 8 1.3 培养基的配制 1.3.1 LB 液体培养基及其配制：胰蛋白胨 10g 酵母菌提取物 5g NaCl 10g 加入去离子水 900ml 溶解，混匀后用 10mol/L NaOH 调 PH 值至 7.2-7.6，加水定容至 1000ml，在 1.034105Pa 高压蒸汽灭菌

23、（至少 20 分钟），置室温冷却后，4保存。 1.3.2 LB 固体培养基及其配制：胰蛋白胨 10g 酵母菌提取物 5g NaCl 10g 琼脂 5g 加入去离子水 900ml 溶解，混匀后用 10mol/L NaOH 调 PH 值至 7.2-7.6，加水定容至 1000ml，在 1.034105Pa 高压蒸汽灭菌（至少 20 分钟），置室温冷却至 60时，加入相应浓度所需抗生素，无菌条件下倾倒平板，凝固后保存于 4冰箱。 1.3.3 SOB 液体培养基及其配制：胰蛋白胨 20g 酵母菌提取物 5g NaCl 10g KCl 0.186g 双蒸水定容至 1000ml，混匀后在 1.

24、034105Pa高压蒸汽灭菌（至少 20 分钟）。然后再加入 10ml经过高压灭菌的 1mol/LMgCl2溶液。华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 91.4 工具酶和分子量标准 Taq DNA 聚合酶宝生物工程（大连）有限公司 TaKaRa LA Taq 宝生物工程（大连）有限公司限制性内切酶 EcoR 宝生物工程（大连）有限公司限制性内切 Sal 宝生物工程（大连）有限公司 T4 DNA 连接酶宝生物工程（大连）有限公司 DL 2000 分子量标准宝生物工程（大连）有限公司中分子量蛋白质标

25、准美国 Fernebtas 公司 1.5 生化试剂和其它使用试剂胰蛋白胨英国 OXOID 公司琼脂糖美国 Promega 公司酵母提取物英国 OXOID 公司质粒DNA小量纯化试剂盒宝生物工程（大连）有限公司十二烷基硫酸钠（SDS）美国 Fluka 公司丙烯酰胺美国 Amresco 公司 TEMED 美国 Amresco 公司异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）美国 Promega 公司 GST抗体武汉三鹰生物公司 HRP 标记的羊抗兔 IgG 抗体美国 Senta Cruz 公司福氏完全/不完全佐剂美国 Sigma 公司超滤管美国 Milipore

26、公司 X-ray 胶片美国 Kodak 公司 BSA 血清杭州四季青生物公司 BHK 细胞本实验室保存 Lumi-lightpluswestern blot kit 美国 Roche 公司 DNA 凝胶回收试剂盒宝生物工程（大连）有限公司华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 10 1.6 其它相关试剂的配制： 1.6.1 诱导蛋白表达相关试剂的配制： 1.0M IPTG贮存液的配制: IPTG 500mg ddH2O 2 ml 用 0.22m滤膜过滤除菌，保存于-20。使用时需要 1：1000 稀释。

27、1.6.2 蛋白电泳相关试剂的配制： 30%丙烯酰胺/0.8%N,N亚甲双丙烯酰胺: 丙烯酰胺 11.7g 蒸馏水 29ml （溶解） N,N亚甲双丙烯酰胺 0.32g 定容体积为 40ml，置 4避光保存。浓缩胶缓冲液的配制： Tris-HCl (pH 6.8) 浓度 0.5mmol/L 分离胶缓冲液的配制： Tris-HCl (pH 8.8) 浓度 1.5mmol/L 5Tris-甘氨酸电泳缓冲液的配制：甘氨酸 47g Tris Base 7 .55g SDS（10%） 25ml 去离子水 500ml 先用400ml去离子水溶解Tris Base和甘氨酸，最后用去离子水定容至500m

28、l。 2SDS-PAGE 加样缓冲液的配制： 10% SDS 4ml 华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 11 0.5mol/L Tris-HCl（pH6.8） 2ml 甘油 2ml 二巯基乙醇 1ml 1% 溴酚蓝 1ml 考马斯亮蓝染色液的配制（SDS-PAGE 电泳）：各成分比例如下（v/v）甲醇 50% 乙酸 10% 去离子水 40% 考马斯亮蓝（R-250） 0.05% 考马斯亮蓝脱色液的配制（SDS-PAGE 电泳）：各成分比例如下（v/v）甲醇 50% 双蒸水 40% 乙酸 10% 1

29、.6.3 Western blotting 相关试剂的配制： PBST (Tween 20/TBS)：的配制： Tween 20 10l PBS 10ml 充分混匀后可于 4保存备用。转移缓冲液的配制：甘氨酸 86.5g 华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 12 Tris 碱 18.2g 甲醇 1200mL 先溶于 4L 水，然后加蒸馏水定容至 6L。调节 pH 为 8.38.4。 PBS 的配制（0.01M 磷酸盐缓冲液）： NaCl 8g Na2HPO4 1.44g KH2PO4, 0.24g KCl

30、 0.2g 先溶于 800ml 蒸馏水中，用 HCl 调节溶液的 PH 值至 7.4，最后加蒸馏水定容至 1L 即可。高压下蒸馏水灭菌（至少 20 分钟），室温保存。 D-72 显影液：无水碳酸钠 67.5 g 无水亚硫酸钠 45 g 几奴尼 12 g 米吐尔 3 g 溴化钾 2 g 温水 750 ml 先在 750ml 温水中充分溶解，最后加冷水定容至 000 ml。 F-5 定影液：硫代硫酸钠 240 g 无水亚硫酸钠 15 g 钾矾 15 g 硼酸 7.5 g 华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文

31、13 28% 醋酸 48 ml 温水 700 ml 先在 700ml 温水中充分溶解，最后加冷水定容至 1000 ml。 1.6.4 蛋白纯化相关试剂的配制（电洗脱法）电洗脱法电泳缓冲液：甘氨酸 47g Tris Base 7.55g 先在 400ml 去离子水中充分溶解，最后加去离子水定容至 500ml。 1.6.5 应用考马斯亮蓝 G-250 染色法检测蛋白浓度相关试剂的配制：储存液：考马斯亮兰 G-250 350mg 88%磷酸 200 ml 95%乙醇 100 ml 工作液：储存液 30 ml 88%磷酸 30 ml 95%乙醇 15 ml 双蒸水 425 ml 充分混匀后

32、，用 0.22m 滤膜过滤除菌，室温下保存于棕色瓶中，使用前需再次过滤后才能使用。 1.6.6 纯化多克隆抗体相关试剂的配制醋酸盐缓冲液的配制（浓度 0.06M ，pH 4.8）贮存液的配制： A 液（NaAc，浓度为 0.06M）无水 NaAc 0.49218g 华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 14 蒸馏水 100ml （定容） B 液（HAc，浓度为 0.06M）冰醋酸 0.344ml 蒸馏水 100ml （定容）应用液的配制： A 液 59ml B 液 41ml 充分混匀，然后用 5M

33、NaOH 调节 pH=4.80。磷酸盐缓冲液(PBS，0.lM ，pH 7.4)的配制： Na2HP0412H20 28.94g, KH2P04 2.61g 先在 900ml 蒸馏水中充分溶解，最后加蒸馏水定容至 1000ml。磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)： Na2HP0412H20 28.94g NaCl 18.0g KH2P04 2.61g KCl 0.2g EDTA 0.06g, 先在 900ml 蒸馏水中充分溶解，最后加蒸馏水定容至 1000ml。华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 15

34、2.方法 2.1 PCR 引物设计与合成通过与其他物种（如人，大小鼠，牛等）CTLA4 序列的比对，发现物种之间的同源性很高，我们在土拨鼠的胞外段设计 CTLA4的特异性引物，并在引物末端引入保护碱基、EcoRI, SalI 的酶切位点。PCR引物由上海英骏（invotrigen）公司合成：上游引物（PGTK-2XF-CTLA4）: 5-ATGAATTCAAAGCG ATGCACGTGGCCCAG -3 EcoR 下游引物(PGTK-2XF-CTLA4): 5-TGTCGAC ATCAGA ATCTGGGCATGGTTC-3 Sal 2.2 重组质粒 PGTK-2XF-CTLA4 表达载体

35、的构建 2.2.1 质粒 PGTK-2XF 由质粒 PGEX 改建而来，质粒 PGEX 的图谱如下：华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 16 质粒 PGEX（图谱）重组质粒 PGTK-2XF-CTLA4 构建具体步骤如下： 2.2.2 PCR 扩增目的基因 CTLA4 反应体系如下：成分使用浓度用量 10PCR buffer 5l 华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 17 dNTPs 10mmol/L 1l 上游引物

36、10mol/L 1l 下游引物 10mol/L 1l Taq polymerase 5u/l 1l DNA plate 1l ddH2O 40l 总体积 50l PCR 反应程序如下：始变性：94 5min；主循环：94 60sec，55 60sec，7260sec， 30cycles；终延伸 72 10min。电泳：PCR 反应结束后，首先用 0.5TBE 配制 1.0%琼脂糖凝胶，微波充分煮沸；同时插好电泳梳子，待冷却至 70C 左右时加入 Goldview 溶液，使其终浓度大约为 0.5g/ml，充分混匀，冷却后铺胶，胶面尽量不要留有气泡；取 5-10l PCR 产物在

37、10V/cm 条件下进行电泳，并在紫外透射反射分析仪下观察结果。如果获得特异性条带后，切胶回收纯化 PCR 产物备用。 2.2.3 回收纯化 PCR 产物：胶回收试剂盒由宝生物工程（大连）有限公司提供，具体操作步骤如下： 1. 使用TAE缓冲液或TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。 2. 在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶（尽可能小），用纸巾吸尽凝胶表面的液体。 3. 切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块融化时间，提高DNA的回收率。 4. 称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以 1 mg=1 l 进行计算。华华华华中中中中科科科科技

38、技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 18 5. 向胶块中加入胶块融化液 DR-I Buffer，DR-I Buffer 的加量如下表：凝胶浓度 DR-I Buffer用量 1.0 3个凝胶体积量 1.01.5 4个凝胶体积量 1.52.0 5个凝胶体积量 6. 均匀混合后75加热融化胶块（低熔点琼脂糖凝胶只需在45加热）。此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约610分钟）。 7. 向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer量的1/2体积量的DR-II Buffer，均匀混合。当分离小于400 bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为

39、20%的异丙醇。 8. 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。 9. 将上述操作7的溶液转移至Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。 10. 将500 l的Rinse A加入Spin Column中，12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。 11. 将700 l的Rinse B加入Spin Column中，12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。 12. 重复操作步骤11。 13. 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入25 l的灭菌蒸馏水或Elution Buffe

40、r，室温静置1分钟。注）把灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至60使用时有利于提高洗脱效率。 14. 12,000 rpm离心1分钟洗脱DNA。 2.2.4 将纯化的 PCR 产物按以下反应体系进行酶切：反应体系如下：成分使用浓度用量 10H buffer 2ul EcoR 4-12u/ul 1ul Sal 4-12u/ul 1ul PCR 回收产物 10g /ul 10ul 华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 19 dH20 6ul 总体积 20ul 混匀上述体系后，置 37水浴箱内酶切

41、3 小时。电泳：在酶切过程中分别制备 1的琼脂糖凝胶，酶切完成后在 0.5TBE 电泳缓冲液中进行 10V/cm 电泳，紫外透射反射分析仪下观察结果。切下约 400bp 大小的目的片段，按照 DNA 凝胶回收试剂盒说明书回收后备用。具体步骤同 2.2.3。 2.2.5 质粒 PGTK-2XF 经 Sal、EcoR双酶切后回收线性化空载体。酶切反应体系如下：成分使用浓度用量 10H buffer 2ul EcoR 4-12u/ul 1ul Sal 4-12u/ul 1ul 质粒 1g /ul 1ul dH20 15ul 总体积 20ul 混匀上述体系后，置 37水浴箱内酶切 3 小

42、时。电泳确定酶切结果，具体操作步骤同前。 2.2.6 目的 DNA 和载体的连接：取 2ul 线性化载体，与 10ul 的目的基因片段，在 T4 连接酶作用下，16连接过夜。连接反应体系如下：成分使用浓度用量 10ligation buffer 2l 华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 20 T4 DNA ligase 350 u/l 1l 载体部分酶切产物 0.2g/l 2l 目的基因酶切产物 0.2g/l 10l ddH2O 5l 总体积 20l 2.2.7 连接产物的转化与扩菌培养： 1) 无菌状

43、态取新鲜感受态细胞 200ul 置冰水浴中待其自然解冻。 2) 加入连接产物 10ul，轻柔混匀后继续冰浴 30min。 3) 42水浴 90sec，再次冰浴 10-15min。 4) 管中加入 800ul 培养基（不含抗生素），37恒温摇床，250rpm，45-60min。 5) 每管取 200ul 菌液加入 LB 琼脂平板（含 Amp 100ug/ml），涂板。 6) 平板置室温干燥后，37培养过夜。 7) 挑取单个菌落于 1ml AmpLB 培养基内，37 250rpm，震荡培养 8-12 小时。附：感受态细胞的制备（以 DH5为例） 1. 取-20或-70贮存的大肠杆菌 DH5

44、菌种，用一个铂金接种环直接取菌液。在 LB 琼脂平板（不含抗生素）上划线，37培养过夜（1216 小时）。 2. 从平板上挑取一个菌落接入含 1ml LB 培养基的试管中，37振荡培养过夜（恒温摇床，250rpm）。 3. 取 0.2ml 菌液转入含 100ml LB 培养基的三角瓶中，37振荡培养约 2.5 小时（OD6000.2）。 4. 冰水浴 30 分钟。 5. 培养物转入 50ml 预冷的离心管中，离心 4000rpm, 4, 10min。 6. 弃上清，将细菌重新悬浮于 25ml 100mmol/L 预冷的 CaCl2中，冰浴 30min，华华华华中中中中科科科科技技

45、技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 21 离心 2500rpm, 4, 10min。 7. 弃上清，将细菌重新悬浮于 25ml 100mmol/L 预冷的 CaCl2中，冰浴 30min，离心 2500rpm, 4, 10min。 8. 弃上清，将细菌重新悬浮于 1.4ml 100mmol/L 预冷的 CaCl2和 0.7ml 预冷的甘油中，轻柔混匀后-70保存待用。 2.3 转化子的鉴定 2.3.1 转化产物的鉴定取上述连接产物的转化菌液做 PCR 鉴定，反应体系及反应条件如下：成分使用浓度用量 10PCR buffer 5ul dN

46、TPs 10 mmol/L 1ul 上游引物 10 mmol/L 1ul 下游引物 10 mmol/L 1ul Taq polymerase 5g /ul 0.5ul Plate 0.3OD 1ul dH20 40.5ul 总体积 50ul PCR 反应程序如下：始变性：94 6min 主循环：94 60sec ，55 60sec ，72 60sec，30 个 cycles 终延伸：72 10min 华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 22 PCR 反应结束后，在 1.0的琼脂糖凝胶中，以 10V/cm 在

47、0.5TBE 缓冲液中进行电泳，电泳结束后在紫外透射反射分析仪下观察，结果发现有大小 400bp左右的目的片段。 2.3.2 重组质粒（阳性）的制备挑取 PCR 鉴定阳性的克隆，继续扩大培养，并进行常规小量质粒提取。 2.3.3 质粒提取实验操作步骤如下：（博大泰克公司质粒小量提取说明书） 1) 收集 1.5ml-3.0ml 菌液于 1.5mlEppendorf 管中，10000rpm 离心 2 分钟，弃上清。 2) 加入预冷的 solution100ul，振荡至彻底悬浮。 3) 加入溶液150ul，立即轻柔翻转混匀，使菌体充分裂解，裂解后的菌体变得清亮。随后将离心管放置于冰上 1-2 分

48、钟。 4) 加入溶液150ul，轻柔翻转混匀，冰上放置 5 分钟。 5) 室温离心 12000rpm，12 分钟。 6) 将 420ul 结合缓冲液加入离心吸附柱中，然后将步骤 5 中的上清加入离心吸附柱中（尽量去除杂质），混匀，12000rpm，30 秒。倒掉废液收集管中的废液。 7) 加入 750ul 漂洗液于离心吸附柱中，静置 1 分钟后 12000rpm，30 秒。倒掉废液收集管中的废液。重复一次。倒掉废液后，再次于 12000rpm，离心 2分钟，尽量出去漂洗缓冲液。 8) 小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的 1.5mlEppendorf 管中，加入适量洗脱缓冲液，常规 50u

49、l，室温下放置 2-5 分钟，12000rpm，1 分钟。 9) 用紫外分光光度计测定其 OD 和 OD，并计算其浓度和纯度。 10) 对产物进行下面的酶切鉴定，其余部分置-20或-70保存待用。 2.3.4 构建质粒载体的双酶切鉴定和测序：华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 23 2.3.4.1 用 EcoR,Sal对纯化重组质粒进行酶切鉴定。酶切鉴定体系如下：成分使用浓度用量 10H buffer 2ul EcoR 4-12u/ul 1ul Sal 4-12u/ul 1ul 纯化重组质粒 1.0g

50、 /ul 1ul dH20 15ul 总体积 20ul 充分混匀上述体系后，置 37水浴箱内酶切 3 小时左右。电泳：在酶切过程中制备 1琼脂糖凝胶，酶切反应结束后以 10V/cm 在 0.5TBE电泳缓冲液中进行电泳，电泳结束后在紫外透射反射分析仪下观察结果，可见重组质粒用 EcoR,Sal酶切后获得 400bp 左右的片段。 2.3.4.2 重组质粒的核酸序列测定经上述 PCR 鉴定和酶切鉴定正确的阳性克隆（PGTK-2XF-CTLA4）送上海英骏（invotrigen）公司进行测序，并与 CTLA4 的原始序列比较，以鉴定核苷酸序列的正确性。 2.4 将成功构建的重

51、组质粒 PGTK-2XF-CTLA4 转化高效表达菌 E.coli BL21(DE3) 2.4.1 重组质粒 PGTK-2XF-CTLA4 转化表达菌感受态细胞转化方法见 2.2.8 部分，转化后的菌液均匀涂布于 100g/ml Amp和 35g/ml Chloramphenicol 的选择性培养基（SOB）上进行筛选。附： E.coli BL21(DE3)高效表达菌感受态细胞的制备制备方法同 2.2.7 部分。华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 24 2.4.3 转化子的 PCR 筛选

52、以上、下游引物做 PCR，对转化后生长的单个克隆进行鉴定，电泳后观察是否有约 400bp 大小的目的片段出现。反应体系及条件同 2.3.1。 2.5 目的基因的原核表达先用不同浓度，不同时相 IPTG 小量诱导宿主菌目的蛋白的表达。 2.5.1 小量诱导表达的具体操作步骤如下： 1）挑取一个鉴定阳性的单克隆加入到 8ml 的 SOB 培养液中（含抗生素），37 ，250rpm 振荡培养约 5 个小时（ OD600= 0.50.6）。 2）取 1ml 菌液，离心后取菌体沉淀，于-20冻存。 3）在剩余 7ml 菌液中加入 1M IPTG 并最终使其浓度达到 1mM，然后继续诱导培养

53、 6h 左右，并随后每隔一个小时取菌液 1ml，离心去上清取菌体沉淀，于-20冻存。 4）在进行上述实验的同时，分别取空菌和未诱导的重组菌做阴性对照和空白对照。 5）向菌体沉淀中加入 100ul 1SDS 上样缓冲液，100煮沸 10min，室温12000rpm 离心 1min，自然冷却待用。小量诱导表达后，确定最优化的条件然后进行大量诱导表达，离心诱导表达的菌液后再纯化包涵体（目的蛋白以包涵体的形式存在）。 2.5.2 菌体总蛋白的 SDS-PAGE 和 Western blot 分析 2.5.2.1 菌体总蛋白的 SDS-PAGE 电泳具体操作步骤如下： 1）洗净玻璃板，按照说明安

54、装玻璃板，注意胶条要上好，否则会漏胶。 2）根据配方表配制 15ml 12的分离胶和 5ml 5的浓缩胶。并按照顺序依次混合各个成分，一般先加去离子水，最后加 TEMED。 3）将配制好的丙烯酰胺混合液(分离胶)灌至胶板的间隙中，在离玻璃板上缘大华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 25 约 1cm 处停止灌胶。然后在胶上面加一部分去离子水，其主要作用是防止氧扩散到凝胶中从而抑制聚合作用。 4）一般在 30min 后聚合就可以完成，这时立即倒掉覆盖层的去离子水，再用去离子水清洗凝胶几次以除去残留未聚合的丙烯酰胺

55、。必要时可以用吸水纸吸尽残留的水。 5）把预先配制好的浓缩胶小心灌入，随后立即插入 Teflon 梳子，这时要特别注意不要混入气泡，再补加一些浓缩胶彻底填满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温直到凝胶全部凝固。 6）待聚合完成后，将玻璃板固定在电泳装置中，小心加入电泳缓冲液，尽量避免气泡的产生，迅速拔下梳子，可以用缓冲液清洗加样槽，必要时可以用平头针头扶直浓缩胶的齿，以利于加样。 7）按实验的预定次序加样，上样量为 20ul/ 孔，一般在非加样孔内加入等量的1SDS 上样缓冲液作为阴性对照。 8）在 70v 左右进行恒压电泳。如果样品迁移至浓缩胶与分离胶的分界处时，应该迅速将电压调至 140v

56、，当溴酚蓝迁移至分离胶时，可以停止电泳。从电泳装置上卸下玻璃板，放入水中并剥下玻璃板上的凝胶。 9），从玻璃板上剥下的凝胶用于下面的考马斯亮蓝染色。 10）将剥下凝胶放在干净的塑料容器中，加入 3-5 倍体积的考马斯亮蓝染色液直到能全部覆盖凝胶为止，然后在摇床上缓慢摇动 4 小时以上进行染色。 11）倒掉染色液，再以和染色液同样体积的脱色液覆盖凝胶，在摇床上缓慢摇动2 小时进行脱色。倒掉脱色液，加入新的脱色液，并重复上述步骤直至获得蓝色条带和比较干净的背景。 2.5.2.2 菌体总蛋白的 Western blotting 分析：菌体总蛋白完成 SDS-PAGE 电泳后立即进行转膜，转膜后

57、利用兔抗 GST 抗体作为一抗，HRP 标记的羊抗兔 IgG 作为二抗对目的蛋白的表达进行 Western blot检测。具体操作步骤如下：华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 26 1) 电泳后在水中剥下玻璃板上的凝胶并尽快进行转移。 2) 准备转印膜并将 NC 膜按凝胶大小或略小于凝胶剪膜。 3) 将凝胶放入去离子水中浸泡大约 5 分钟，其主要目的是除去存留于滤膜上的气泡。然后转入转印缓冲液中平衡 10-15 分钟。 4) 同时把十几张滤纸浸泡在另外一个大号的培养皿中，大号的培养皿已经提前加入转移缓冲液，

58、。 5) 平放槽芯的石墨正极板后，依次按顺序放入滤纸，硝酸纤维素膜，凝胶和滤纸。所有片层材料预先都需要经转印膜转移缓冲液浸湿，并且特别要注意夹层系统中绝对不能有气泡产生。 6) 上述步骤完成后加盖槽芯的负极板。然后直接将组装好的槽芯系统装入转移槽芯系统中。注意：需要再次确定凝胶朝负极，硝酸纤维素朝正极。 7) 平放转移槽，在 85mA 下电泳 2 个小时左右。 8) 电泳完成后，拆卸电泳转移装置，并用镊子把滤膜轻轻放入预先准备好的容器中。 9) 用 3的适量 BSA/TBS 溶液进行封闭。37，60 分钟左右。 10) 弃去封闭液，用 PBST 洗膜 3 次。 11) 洗膜 3 次后弃去 PB

59、ST，再加入用 0.5BSA/TBS 稀释的一抗。37，2 个小时，也可以 4孵育过夜。 12) 用 PBST 洗膜 3 次，每次 15 分钟，弃去一抗。 13) 弃去 PBST。加入用.5BSA/TBS 稀释的二抗。37，1 个小时，或者 4孵育过夜。 14) 用 PBST 洗膜 3 次，每次 15 分钟，弃去二抗。 15) 弃去 PBST，将膜置于双蒸水中浸泡几分钟。 15）分别取 Lumi-light-A 和 Lumin-light-B（Roche）100-150ul 进行混合。用镊子将膜小心放于透明的塑料膜上，均匀加上述混合液 200-300ul，再加盖一层透明塑料膜。在 37避光 5

60、min。然后将夹有透明塑料膜的 NC 膜夹于 X 胶片夹中曝光 10min 左右。华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 27 16） X 胶片的显影：在暗室中小心并迅速地从 X 胶片夹中取出 X 胶片，置于 D-72液中显影 5min，然后用清水冲洗干净。 17) X 胶片的定影：再在 F-5 液中定影 5min，然后用清水冲净，室温晾干后观察结果。 2.5.2.3 表达产物水溶性鉴定及包涵体收集：诱导表达菌液在 4000rpm,离心 25min，收集菌体，按菌液：裂解缓冲液=10：1的比例加入裂解缓冲液

61、，重悬沉淀。对上述菌液进行反复冻融，条件如下： -70 1h 37 20min 反复冻融完成后再进行至少四次超声破碎处理。条件如下： 750W 40P（功率）超声 5sec 间隔 10sec 超声时间 30min 10000rpm，4离心 30min，离心后分别取上清及沉淀，再进行SDS-PAGE电泳分析。电泳结果发现目的蛋白主要出现在沉淀部分，并以不溶性包涵体形式存在。 2.6 融合蛋白的大量制备和目的蛋白的纯化： 2.6.1 融合蛋白的大量制备 (1) 在 1000ml新鲜配制的SOB培养基中加入 20ml菌液（1：50 稀释），37，250rpm进行培养（OD600=0.40.6

62、），加入 1000lIPTG（1mol/L），使IPTG终浓度达到 1.0mM，然后在 37，250rpm的条件下继续培养 5 个小时。 (2) 菌液的反复冻融及超声破碎（操作步骤同 2.5.2.3）。 12000rpm，离心 30min裂解菌液，弃上清，可于-70冻存。如果将沉淀溶于 2ml PBS，则可在-20进行保存。华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 28 2.6.2 目的蛋白的纯化（电洗脱法） (1) 取上述超声破碎沉淀溶液 500l, 常温解冻后加入 5SDS 上样缓冲液。进行 SDS-

63、PAGE 电泳。 (2) SDS-PAGE 电泳步骤同前。 (3) 电泳完毕后，在水中从玻璃板上剥下凝胶。 (4) 用 0.25M 预冷的 KCl 染色 3min，可以发现目的蛋白条带。 (5) 切下目的蛋白条带，放入已加入电泳缓冲液的电洗脱仪里，在 4进行电泳。 (6) 24mA 进行电泳，4 个小时，电泳完成后转移全部电泳液至超滤管中。 (7) 通过超滤管回收得到的即是纯化的目的蛋白。取纯化蛋白液20l，加2蛋白电泳上样缓冲液20l于管中， 100煮沸5min。SDS-PAGE 电泳，考马斯亮蓝染色后观察纯化效果。 2.6.3 检测蛋白纯度和浓度：纯化的样本要进行 SDSPAGE 电

64、泳以检测样本的纯度，并用考马斯亮兰G-250 法测定蛋白浓度，为下一步免疫动物作好准备。 2.7 动物免疫动物免疫实验之前十天在兔子足底注射福氏完全佐剂，1ml/只，其主要作用是激活机体的免疫系统。将纯化得到的目的蛋白 600g，与等体积福氏不完全佐剂混合，按 200g/只的抗原剂量，分别免疫 3 只新西兰大白兔，注射途径是皮下多点注射。在第 14天和第 28 天各加强免疫 1 次，加强免疫的方法和抗原剂量与第一次相同。在第35 天心脏采血，静置后分离血清，然后分别检测 3 只兔子的血清效价。 2.8 多克隆抗体的纯化(辛酸-硫酸氨盐析法) 1. 取兔血清，用新华滤纸过滤 1-2 次，其主

65、要目的是除去沉淀和部分脂质。华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 29 2. 滤液：60mmol/L 醋酸缓冲液（PH4.0）=1：4 进行体积稀释，并以 NaOH 调节 PH 至 4.5 左右（4.2-4.8）。 3. 逐滴加入辛酸，使其终浓度为 25ul/ml，在室温条件下搅拌 30 分钟后，6000-8000 转/分钟离心 30 分钟，收集上清。注意必须逐滴加入辛酸，不能过快。 4. 用新华滤纸再过滤上清 2-3 次，滤液与 10 倍 PBS（0.1mol/L，PH7.4）按 10：1 比例混合，调 P

66、H 至 7.4 左右，再冰浴 10 分钟。 5. 取 1 毫升上述混合液，再加入 0.277 克固体硫酸氨， 4 搅拌 30 分钟，4000-6000 转/分钟，离心 15-20 分钟。 6. 去掉上清，将沉淀物溶于少量 PBS，在 4透析后收集。 7. 测定纯化的多克隆抗体浓度。 2.9 多克隆抗体的检测 2.9.1 酶联免疫吸附实验（ELISA） 1. 用所得目的蛋白包被酶联免疫吸附板（ELISA 板），100l/孔（浓度为0.06mg/L），4 过夜，然后先用 PBST 洗三次，再用 10PBS/ PBST 37封闭 2h，封闭完成后加入免疫兔血清（倍比稀释）50l 于相应孔中。设阴

67、性对照（正常兔血清 50l）和空白对照（50l 洗涤液）。37 ，孵育 60min。 2. 步骤 1 完成后，甩去孔中液体，拍干，用 PBST 洗涤液注满各孔，静置 3min，再甩去孔中液体，拍干。重复上述步骤 5 次。 3. 加 HRP 标记的羊抗兔 IgG50l 于各孔中（1：2000 稀释），包括阴性对照和空白对照。37，孵育 45min。 4. 重复步骤 2。 5. 分别加显色剂 A 液 50l 和显色液 B 液 50l 于所有孔中，在振荡器上充分振荡，然后置室温避光显色 10min 左右。 6. 加终止液 50l 于各孔中，在振荡器上充分振荡混匀后在酶标仪上进行检测，检

68、测波长为 450nm。正常兔血清为阴性对照，以空白对照孔调零。华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 30 2.9.2 免疫荧光检测 1. 将已经构建好的 PW-CTLA4 转染 BHK 细胞，48 小时后，弃去培养基，再用PBS 洗三遍，最后用预冷的 50甲醇固定 15min，风干待用。 2. 用 PBS 洗 BHK 细胞一遍，室温静置 5min。 3. 用 10的正常羊血清对转染的 BHK 细胞进行封闭，37，30 分钟左右。 4. 封闭完成后弃去封闭液，然后加入已稀释好的免疫兔血清作为一抗。阴性对照为正常兔

69、血清。 537孵育 1h，然后用 PBS 洗三遍，每次间隔 5 分钟。 6. 再加入 FITC 标记的羊抗兔 IgG 作为二抗（1：50 稀释）， 7. 重复操作 5 8，在荧光显微镜下观察结果，并拍照记录实验结果。 2.9.3 Wesern blot 检测 2.9.3.1 质粒 PW-CTLA4 转染 BHK 细胞 48 小时后，用 1SDS 上样缓冲液收集转染细胞，100煮沸 5min，然后再进行 SDS-PAGE 电泳。 2.9.3.2 Wesern blot 检测具体步骤如下： 1）-7）步骤同 2.5.2.2 8) 弃去 PBST 洗液，加入免疫兔血清（已用 0.5BSA/PB

70、S 进行稀释）作为一抗，阴性对照为正常兔血清。37，水平摇动 2 小时，也可以 4孵育过夜后再进行下面的实验。 9) 用 PBST 洗膜 3 次，每次 15min，弃去一抗。 10) 弃去 PBST 洗液。再加入 HRP 标记的羊抗兔 IgG（已用 0.5BSA/PBS 进行稀释）作为二抗。37温，水平摇动 1 小时，也可以 4孵育过夜。 11) 用 PBST 洗膜 3 次，每次 15min，弃去二抗。 12）以下步骤同 2.5.2.2。华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 31 结果 1. 目的基因的获得和

71、重组质粒的构建和鉴定 PCR 产物经 1琼脂糖凝胶电泳可见大小约为 400bp 的特异性片段（图 1）。用 EcoR和 sal对重组质粒经进行双酶切后鉴定，得到约 400bp 大小的片段，与预期的大小一致（图 2）。测序结果同 CTLA4 的原始序列比较，核苷酸的同 PCR 鉴定结果图 1(Fig1) 质粒酶切鉴定图 2（Fig2） 1.Marker DL2000 (bp) 1、Marker DL2000（bp） 2.PCR product of CTLA4 2、PGTK-2XF 3.PCR product of CTLA4 3、Digestion with EcoRSal 4、Dig

72、estion with EcoRSal 5、Digestion with EcoRSal 源性为 100%，以上结果证明 CTLA4 序列已经成功插入 PGTK-2XF 载体。华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 32 2. 目的蛋白的检测 2.1 目的蛋白诱导表达 4h 后进行 SDS-PAGE 电泳发现得到的量最大并可见明显的目的条带（图 3）。超速离心后分别取上清和沉淀进行 SDS-PAGE 电泳发现发现目的蛋白主要以包涵体（沉淀部分）的形式存在。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 目的蛋白检测

73、图 3（Fig 3） 1: Protein marker （KD） 2: PGTK-2XF-CTLA4 0h 3: PGTK-2XF-CTLA4 IPTG 1mM 4h colony #1 4: PGTk-2XF-CTLA4 IPTG 1mM 4h Colony #2 5: PGTK-2XF-CTLA4 IPTG 1mM 4h Colony #1 pellet after sonication 6: PGTK-2XF-CTLA4 IPTG 1mM 4h Colony #2 pellet after sonication 7: PGTk-2XF-CTLA4 IPTG 1mM 4h Colony

74、 #3 pellet after sonication 8: PGTK-2XF-CTLA4 IPTG 1mM 4h Colony #3 supernatant after sonication 9: PGTK-2XF-CTLA4 IPTG 0mM 4h 10: PGTk-2XF IPTG 1mM 4h 25 34 49 85 119 KD 华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 33 2.2 电洗脱法纯化目的蛋白(图 4) 图 4（Fig 4） Purification of interest protein 1.

75、 Protein marker 2. Interest protein 2.3 目的蛋白的 Western blot 检测对目的蛋白进行 Western blot 检测（以 GST 抗体为一抗），结果发现 1 重组未诱导菌无任何条带，诱导菌 2 在 40KD 处可发现有较强的条带，空质粒 3 在 26KD也有条带，上述试验结果提示经过诱导后获得了目的蛋白。（图 5） KD 1 2 25 34 49 85 40KD 117 华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 34 3. 多克隆抗体的纯化图（辛酸-硫酸铵

76、盐析法）（图 6） 4. 多克隆抗体检测 4.1 多克隆抗体效价检测结果（ELISA 方法）将电洗脱纯化的重组蛋白进行包被，然后分别检测 3 只免疫兔血清的抗体效价，试验结果显示效价最高可达 1：160 000 4.2 PW-CTLA4-HBc 转染 BHK 细胞后的免疫荧光结果图（图 7）图 7（Fig 7） Stained by immunofluorescence after PWCTLA4-HBc transfect BHK 华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 35 4.3 多克隆抗体的特异性检测

77、结果对多克隆抗体进行 Western blot 检测，结果发现在 40KD 左右有明显的特异性条带（以免疫兔血清为第一抗体），而正常兔血清无条带（阴性对照）（图 8）。图 8（Fig 8） 1: BHK-pwCTLA4 normal rabbit serum 1:1000 2: BHK-pwCTLA4 21# rabbit serum 1:1000 华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 36 讨论乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus， HBV)是导致肝脏疾病最主要的病因之一。虽然在这个

78、领域的世界各国学者对HBV有很广泛的研究，但是缺乏合适的体外动物模型仍然一直困扰学者对乙型肝炎进行更深入研究，如何找到更适合的动物模型仍旧是我们目前急需解决的难题，目前国内有部分学者正在进行这方面的研究，尝试用鸭、旱獭等动物作为新的动物模型。但是到目前为止，WHV及其宿主东方土拨鼠(Marmota monax)仍是研究HBV最合适的实验小动物模型，它在研究病毒致病机理和筛选治疗性疫苗，选择有效的治疗药物等方面能发挥重要作用。比较其他研究嗜肝病毒动物模型（如黑猩猩模型、鸭乙型肝炎病毒等感染模型），土拨鼠模型与HBV 在基因结构、病毒复制和感染过程及致病性上都较为相似，并且土拨鼠的很多免疫分子和

79、人类高度同源（如CTLA4，PD1等），所以特别适合进行HBV 感染相关免疫机制的研究12,13 。已有研究表明CD4+T淋巴细胞免疫调节紊乱与HBV持续感染机体有相关性14,15，同时CD8+T淋巴细胞在清除急性乙肝病毒感染患者体内的HBV也发挥着重要作用16，以上两个研究结果提示：机体缺乏有效的T细胞免疫应答使得病毒难以清除，并且容易导致乙型肝炎的慢性化。目前我们可以确定，在细胞免疫反应中，有多种共刺激分子参与免疫过程的信号传递，这其中不但包括正向免疫调节，还包括部分负免疫调节作用的分子（如CTLA4，PD1，IL-10等）。其它许多相关的研究也证实乙肝感染程度除了与免疫反应的强度

80、有关，同时还是一个被大量细胞因子调控的过程，其中也包括细胞表面的负免疫调节分子CTLA417。近年来的研究还发现在慢性乙肝患者恢复过程中CTLA4发挥着比较重要的作用。CTLA4的单元型包含有+49位点等位基因和/或+17C，它们可能与乙肝病毒的清除有关，研究的结果显示CTLA4的单元型可能会改变CTLA4的表达量，并下调免疫反应的能力，通过上述研究结果我们可以推测CTLA4的负调节机制华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 37 有助于HBV感染的清除。以前的研究还表明CTLA4外显子49位等位基因单核苷酸

81、多态性（SNP）可能在CTLA4的负调节机制发挥关键作用，因为外显子49位点的等位基因总是与剧烈免疫反应引起的疾病相联系，并增加了疾病的风险。相类似的疾病还包括自身免疫性肝炎，胰岛素依赖的糖尿病， Graves 疾病和系统性红斑狼疮（SLE）等。研究还发现携带49位点等位基因的患者淋巴细胞表面表达少量的CTLA4，在非最适激活条件下淋巴细胞就可以大量增殖，同时增殖的淋巴细胞又抑制了CTLA4的调节功能17-19。 CTLA4 传递抑制性信号给 T 细胞可能使得 CTLA4 在诱导免疫耐受发生的过程中起重要作用。近年来在一些移植模型中的研究也证实，阻断 CTLA4 通路对移植物的长期存活率有影响

82、（一般情况下都是降低长期存活率）。一个特别明显的例子是，在自身免疫性糖尿病动物模型中，非肥胖性糖尿病小鼠淋巴细胞CTLA-4 表达降低；在 CTLA-4 缺陷小鼠模型中甚至出现了严重淋巴增殖现象，并最终导致自身免疫性疾病的发生；通过封闭 CTLA-4 的作用会增加抗性小鼠的自身免疫性神经炎的发病率和严重性。以上的研究说明我们通过封闭 CTLA-4 来控制 CTLA-4/B7 共刺激途径是可以促进自身反应性并同时打破抗性小鼠对外周自身抗原的相对耐受性20 。通过单克隆抗体对CTLA4的封闭作用，可以发现在小鼠动物模型中，CTLA4在抗肿瘤方面发挥重要作用。利用单克隆抗体对CTLA4进行封闭这

83、一策略有可能为各种不同肿瘤疾病的治疗提供新的可行方案，或者也可以认为是一个新的治疗思路。临床实验通过使用完全人源化的单克隆抗体封闭CTLA4，证实了它在各种相关疾病的应用效果21,22。目前临床已经使用的是CTLA4-Ig，它为慢性乙肝患者的治疗提供了一个新的治疗方案。对CTLA4封闭作用引起的相关效应还为我们提供了一个新的研究思路。在本研究中，我们应用基因工程技术将 CTLA4 的基因片段装入原核表达载体PGTK-2XF内, 成功构建了PGTK-2XF- CTLA4质粒，转化到高效表达菌E.coli BL21(DE3)进行诱导表达，并在适当的条件下得到大量的目的蛋白。最后用纯化的目的蛋

84、白免疫动物得到多克隆抗体。使用免疫兔血清作为一抗及 FITC 标记的华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 38 羊抗兔二抗进行多克隆抗体免疫荧光检测提示多克隆抗体可以用于土拨鼠外周血的检测。Western blot 检测也说明制备的多克隆抗体有一定的灵敏度和特异性。综上所述，本研究成功构建了CTLA4的原核表达载体，并制备了CTLA4的多克隆抗体，为下一步使用该抗体对土拨鼠进行相关的免疫学、病毒学研究奠定基础，为土拨鼠感染模型在HBV研究中的应用提供重要的实验材料。华华华华中中中中科科科科技技技技大

85、大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 39 参考文献 1. Lee, W. M. 1997. Hepatitis B virus infection. N. Engl. J. Med. 337:17331745. 2. Yang, H. I., S. N. Lu, Y. F. Liaw, S. L. You, C. A. Sun, L. Y. Wang, C. K. Hsiao, P. J. Chen, D. S. Chen, and C. J. Chen. 2002. Hepatitis B e antigen and the risk of hepa

86、tocellular carcinoma. N. Engl. J. Med. 347:168174. 3. 龚非力等编著。医学免疫学。北京：科学出版社，2003. 4. Brunet J F ,Denizot F ,Luciani M F et al . A new member of the immunogloglobulin superfamily CTLA-4J . Nature ,1987 ;328 (6127) :267. 5. Balzano C ,Buonavista N ,Rouvier E et al . CTLA24 and CD28：similar proteins ,n

87、eighbouring genesJ . Int J Cancer Suppl ,1992 ;7 :28. 6. Krummel MF, Allison JP. CD28 and CTLA-4 have opposing effects on the response ofTcells to stimulation.J ExpMed 1995;182:459-65. 7. WalunasTL, LenschowDJ, Bakker CY, et al. CTLA-4 can function as a negative regulator ofTcell activation.Immunity

88、 1994;1:405-13. 8. Greenwald RJ, OosterwegelMA, van derWoude D,et al. CTLA-4 regulates cell cycle progression during a primary immune response. Eur J Immunol 2002;32:366-73 9. Schneider H, Downey J, Smith A, et al. Reversal of the TCR stop signal by CTLA-4. Science 2006;313:1972-5. 10. 张亚飞解俊侠郜玉峰沈继龙李

89、旭。慢性HBV感染者外周血单个核细胞CTLA-4基因多态性与病情转归的关联研究。实用肝脏病杂志，2008，05：297-298. 11. Chloe L. Thio, Timothy L. Mosbruger,1 Richard A. Kaslow, et al， Cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 gene and recovery from Hepatitis B virus 华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 40 Infection，Journal of virology,

90、 Oct. 2004, p. 1125811262 12 Roggendorf M, M Lu. The Woodchuck :A model for immunopathogenesis and therapy of hepadnaviral infection. Monogr Virol ,2005 ,251 -24. 13 Wang B , Lohrengel B , Lu Y, et al . Molecular characterization of woodchuc -k interleukin 15 (wIL-15) and detection of its expression

91、 in liver samples of woodchucks infected with woodchuck hepatitis virus. (WHV) Cytokine , 2005 ,32296-303 14. Brooks DG，Teyton L，Oldstone MB，et alIntrinsic unctional dysregu- -lation of CD4 T cells occurs rapidly following persistent viral infection JJ Virol，2005,79(16)：1051410527 15. Boeher WO，Gahm

92、 E，Marcus H et alReduced hepatitis B virus surface Antigen-specific Thl helper cell frequency of chronic HBV carriers is associated with a failure to produce antigen-specific antibodies In the trimera mouseJHepatology，2000，31(2)：480-487 16. Thimme R，Wieland S，Steiger C，et a1CD8(+) T cells mediate vi

93、ral clearance and disease pathogenesis during acute hepatitis B virus infectionJJ Virol，2003，77(I)：68-76 17. Chloe L. Thio, Timothy L. Mosbruger, Richard A. Kaslow, Christopher L. Karp,Steffanie A. Strathdee,David Vlahov,Stephen J. OBrien,Jacquie Astemborski, and David L. Thomas. Cytotoxic T-lymphoc

94、yte antigen 4 gene and recovery from Hepatitis B virus Infection .Journal of virology,p1125811262 18. Ligers, A., N. Teleshova, T. Masterman, W. X. Huang, and J. Hillert. 2001.CTLA-4 gene expression is influenced by promoter and exon 1 polymorphisms.Genes Immun. 2:145152. 19. Maurer, M., S. Loserth,

95、 A. Kolb-Maurer, A. Ponath, S. Wiese, et al. 2002. A polymorphism in the human cytotoxicT-lymphocyte antigen 4 (CTLA4) 华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 41 gene (exon 1 49) alters T-cell activation. Immunogenetics54:18. 20. Zhu J , Zou L ,Zhu S ,et al . J . J Neuroimmunol ,

96、2001 ,115 (122) : 111-117. 21 Hodi FS,MihmMC, Soiffer RJ, et al. Biologic activity of cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 antibody blockade in previously vaccinatedmetastatic melanoma and ovarian carcinoma patients. Proc NatlAcad Sci US A 2003;100:47127-31. 22. Phan GQ,Yang JC, Sherry RM, et

97、 al. Cancer regression and auto- -immunity induced by cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 blockade in patients with metastatic melanoma. Proc Natl Acad Sci USA 2003;100:8372-7 华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 42 综述 CTLA4 的研究进展华中科技大学同济医学院微生物教研室陈尊义摘要：目前可以确定的是：两个来

98、自细胞外的信号刺激才能激活T 细胞，也即T 淋巴细胞活化需要双信号和细胞因子作用。 T 细胞活化的第一信号主要来自T 细胞抗原识别受体(TCR) 与MHC分子抗原肽复合物的特异性结合。T 细胞活化的第二信号是由抗原递呈细胞(APC) 和T 细胞表面的粘附分子对提供，又称共刺激信号，这些粘附分子被称为共刺激分子。在这些共刺激分子中，最重要的是T 细胞表面的CD28、CTLA4 以及APC 表面的相应配体B7 (包括B7-1 和B7-2) 。目前我们已经知道CTLA4主要通过两种机制来抑制T细胞的表达，第一种机制是与抗原递呈细胞表面的CD28竞争性结合B7，第二种机制是通过CTLA4介导的细胞内抑

99、制性信号来抑制T细胞的表达。大量的临床实验已经证实了针对CTLA4的单克隆抗体在治疗多种肿瘤中的作用，它在自身免疫性疾病中的作用也被证实。本文就CTLA4的结构、免疫调节机制及其在临床的应用作一简述。关键词：CTLA4 结构免疫调节临床应用一、CTLA4 结构 CTLA4 分子全称为细胞毒性T 淋巴细胞相关抗原4 (cytolytic T lymphocyte associated antigen 4)。1987 年Brunet 1 等学者发现了CTLA-4 基因。研究表明它含有一个Igv 样胞外功能区、一个跨膜区和一个胞内区。通过比对人，大、小鼠，兔，牛等动物CTLA-4的序列，结果

100、显示它们之间的同源性非常高（土拨鼠与人，牛，大、小鼠，兔CTLA-4序列物种同源性比对结果分别为85，79，78，76，84），进一步的比对还发现人与小鼠胞外V 区同源性为63 %，华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 43 胞内区100 %同源，人与小鼠CTLA-4 分子总的同源性也可以达到76 % 2 。比对土拨鼠与人和其他物种的CTLA-4序列在一定程度上也证明土拨鼠是非常适合作为人乙肝病毒（HBV）研究的小动物模型。此外，在对人的CTLA-4 基因及与人的CD28 基因序列进行比较分析的结果业发现这两种

101、基因结构也是高度同源的，但它们在表达上却是明显的不同：CD28 可以表达于所有的T 细胞表面，而CTLA4 仅在活化的CD8+ T 细胞表面表达，在静息的T 细胞中仅弱表达或者不表达 3 。二、CTLA-4 免疫调节 T 细胞的活化有赖于多种信号的相互作用，抗原提呈细胞（APC)被激活可以表达高水平的共刺激因子，并能提高其处理抗原的能力。如果把 T 细胞置于特定的抗原表位，专职抗原提呈细胞会首先将全长的抗原蛋白以免疫原性蛋白体的形式提呈为多肽，并与 MHC 沟壑细胞表面的 TCR 结合（见图 A）。APC 表面的B7 分子与 T 细胞表面的 CD28 结合，同时还有其他共刺激因子的参与，

102、使得 T细胞活化增殖，产生细胞因子 4 。通过与细胞内部的高尔基体内的激活蛋白(AP-1)结合，T 细胞的活化能激活CTLA4 的转录和表达。除了增加细胞表面的表达，TCR 信号也能引起 CTLA4的磷酸化，这一过程需要 SRC 酶类的参与 5,6 。AP-50 是网格接头蛋白 AP-2 的一个亚单位，CTLA4 的脂质尾区与 AP-50 结合，使得酪氨酸磷酸化被抑制。 CTLA4 与 AP-50 的结合进一步限制了 CTLA4 的内在化，但是确保持续的细胞表达，更多的数据也表明 T 细胞的活化能提高细胞表面的来自之前内在化蛋白产生的 CTLA4 的表达 7，8，但是对这一结论，目前仍然有

103、不同意见。总而言之，表达的 CTLA4 所产生的抑制作用是只是针对已经活化的 T 细胞，对未活化的 T细胞没有作用。在 T 细胞内部，B7 与 CD28 的结合以及 TCR 的参与，使 3-磷脂肪酰肌醇-酶被活化，随后导致 AKT/蛋白酶 B，以及 NF-B 的活化 9 ，这一级联反应能够提高 T 细胞的活化，增殖，和细胞因子的产生。虽然 CTLA4与B7有很高的亲和力，他们的相互作用使得胞内产生多样信号，但是抑制了TCR 华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 44 介导的细胞活化作用，这一过程涉及促

104、细胞分裂蛋白酶的减少和 c-Jun-NH2酶的减少 10 （见图 B）。这一点同时也可以证明 CTLA4 受体的活化是与丝氨酸-苏氨酸磷酸酶 PP2A 的作用是相关的，并以此来调控这些细胞内的信号放大。对这一过程更重要的影响是转录因子的减少，其中包括 NF-KB，AP-1 和其他激活细胞的核分子11,12。CTLA4 参与 T 细胞活化使得细胞因子分泌减少（特别是 IL-2），抑制受体的表达，以及控制细胞周期的发展，使得细胞周期停滞在 G1 期，不向S 期发展13-15 。对 CTLA4 的研究显示它可以提高 T 细胞的动员能力，提高 CTLA4 的表达量可以使 CTLA4 与 TCR

105、竞争性结合受体，阻碍细胞迁移，并使得在细胞活化期间，APC 和 T 细胞能够正确接触。CTLA4 能够通过限制细胞间接触的方式减少细胞的增殖和细胞因子的产生，从而达到调节的作用16 。 CTLA4 对 T 细胞的调节作用华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 45 调节性T细胞( regu lato ry T cell, Treg) 作为一类新被认识的T 细胞亚群近年来引起了各国学者的广泛关注, 它的作用机制不同于机体的“克隆清除”、 “免疫忽视”、“免疫无能”等被动的免疫调节，而是以一种主动性的方式调控机体

106、的免疫应答。目前对于调节性T 细胞的分类仍然存在很多争议，各亚群的命名比较混乱，其中CD4+ CD25+ 调节T 细胞(CD4+ CD25+ T reg) 是调节性T 细胞亚类中的重要组成成分。研究证实CD4+ CD25+ T reg 细胞对自身抗原和非己抗原均有较强的免疫抑制作用17 ，该类细胞缺乏或功能缺陷会导致自身免疫功能紊18 ，这表明CD4+ CD25+ T reg细胞在维持机体内环境的稳定,，诱导免疫耐受以及自身免疫性疾病的发生中发挥重要作用。CTLA4除了在抗原提呈方面的作用外，也通过与调节性T细胞的接触发挥作用。随着对免疫调节和对CTLA4细胞特征的深入研究，我们对CTLA4

107、发挥调节作用的功能也有了进一步的认识。一组在胸腺表达高水平CTLA4的调节性T细胞，由于自身抗原的慢性暴露，CTLA4抑制了其细胞的增殖和细胞因子的产生。Becke等最近的研究也指出，抗CTLA4抗体与调节性T细胞可能存在关系，推断抗CTLA4抗体可能会抑制Treg的分泌，导致自身免疫19 。在天然小鼠体内,Treg是唯一能表达CTLA4抗原的CD4+细胞，在体外实验中也发现抗CTLA4抗体可能消除Treg介导的抑制作用，对成年小鼠注射抗CTLA4抗体还可以导致胃炎的发生 20 。在大肠炎的动物模型实验中也发现，Treg细胞的抑制效果被抗CTLA4抗体所取消，这一点与CTLA4抗原在体内自身免

108、疫性疾病中的作用是一致的。目前对CTLA4影响Treg抑制性功能的假说主要有三种：是否抗CTLA4抗体封闭了Treg细胞表面的CTLA4；抗CTLA4抗体能激CD4+CD25+T 细胞；或者抗CTLA4抗体能避开CTLA4抗原使得CD4+CD25+T细胞对Treg细胞的抑制作用不应答21。封闭CTLA4或者减少Treg的分泌能打破自身免疫，导致非特异性的自身免疫性疾病的发生。 CTLA4封闭后自身免疫和抗肿瘤效果并不是因为Treg的抑制作用或者Treg分泌减少的原因，可能与CD4阳性和CD8阳性效应细胞的激活有关。22 Kajsa Wing等认为调节性T细胞(Treg)是维持自身耐

109、受和免疫稳态的关键环节。研究发现，如果把小鼠体内Treg表面的CTLA4诱导缺陷，可以发生全身性淋华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 46 巴增值， T细胞介导的致死性自身免疫疾病，同时体内和体外试验均发现， CTLA4缺陷的Treg其抑制功能也受到破坏，尤其表现在Treg介导的DC细胞表面CD80、CD86表达降低。由此可以认为，Treg通过影响抗原提呈细胞活化T细胞的能力，起到抑制免疫应答的作用。 CD4阳性细胞的去除能够降低了小鼠自身免疫性疾病的发生。这也提示CTLA4对正常Th细胞的调节是必需的23

110、,24 。 CTLA4 影响 Treg 抑制功能的机制仍未阐明，深入的研究还在进行。三、CTLA4 临床疾病共刺激分子属于免疫蛋白超家族成员，它在天然免疫过程中发挥重要的作用。根据已有的研究表明 CTLA4 在 T 细胞活化过程中起负调节作用,还在诱导自身免疫耐受过程中发挥重要作用，它还可以诱导 T 细胞分化，维持和平衡机体细胞和体液免疫应答。所以我们推测 CTLA4 可能与 T 细胞介导的自身免疫性疾病、移植排斥反应以及机体抗肿瘤、抗感染、抗过敏能力等方面都有关系。全世界有超过3. 5亿的的慢性乙肝病毒感染者，除有一部分治愈外，还有一部分发展为慢性乙肝患者，并最终可能进展为肝硬化或者肝

111、癌。乙肝病毒的清除总是与机体广泛的，激烈的免疫反应相联系。许多研究也表明乙肝感染的程度和免疫反应的强度有关，它同时它又是一个被大量细胞因子调节的过程，其中也包括细胞表面的受体CTLA4。近年来的研究还发现CTLA4的单元型是决定乙肝患者恢复的重要因素，CTLA4的负调节机制有助于HBV感染的清除。以前的某些研究显示CTLA4外显子49位等位基因单核苷酸多态性（SNP）可能在CTLA4发挥负调节过程中起到关键作用，实验的结果提示49位点的等位基因总是与剧烈免疫反应引起的疾病相联系，并且它能提高机体的易感性。这类疾病还包括自身免疫性肝炎，胰岛素依赖的糖尿病，Graves 疾病，和系统性红斑狼

112、疮（SLE）等。通过检测携带49位点等位基因的患者的外周血淋巴细胞，发现可以表达少量的CTLA4，但是在非最适激活条件下淋巴细胞就可以大量增殖，同时增殖的淋巴细胞又抑制了CTLA4的调节功能 25,26,27 。通过收集慢性HBV感染者的血液标本并分离外周血单个核细胞（PBMC），对华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 47 患者CTLA4基因多态性进行相关的研究，结果也证实CTLA4外显子49位等位基因的多态性可能在乙型肝炎病毒感染慢性化过程中发挥作用 28。 CTLA4 能够结合抑制信号并传递给 T 细胞

113、的特点也可能在诱导免疫耐受的发生、发展过程中起重要作用。在自身免疫性糖尿病动物模型中证实了以上这一推测，通过检测非肥胖性糖尿病小鼠淋巴细胞 CTLA4 的表达量，发现表达水平降低；CTLA4 缺陷小鼠模型中还出现严重淋巴增殖现象，并最终导致了自身免疫性疾病的发生；实验还发现通过封闭 CTLA4 的作用会增加抗性小鼠的自身免疫性神经炎的发病率和严重性，这说明通过封闭 CTLA4 来控制 CTLA4/B7 共刺激途径可以促进自身反应性并打破抗性小鼠对外周自身抗原的相对耐受性29 。通过针对CTLA4的单克隆抗体发挥其封闭作用，我们在小鼠动物模型中还发现CTLA4在抗肿瘤方面发挥了重要作用，这一

114、策略有可能为各种不同的肿瘤疾病的治疗提供新的可行方案或者新的研究思路。临床实验通过使用完全人源化的单克隆抗体封闭CTLA4，证实了它在各种相关疾病的应用效果30,31 ，但是到目前为止临床运用最多的是CTLA4-Ig。CTLA4-Ig是通过基因重组产生的CTLA4 分子胞外功能区与免疫球蛋白IgG恒定区相结合的融合蛋白,它最大的优点是能模拟CTLA4的功能，诱导针对特异性抗原的免疫耐受，从而发挥免疫抑制效应。更有学者把CTLA-Ig连接到脂质体上，利用脂质体的特点来强化它抑制T细胞增殖的功能。目前CTLA-Ig已经被证实可以在同种移植，自身免疫病，病毒感染性疾病以及基因治疗中发挥重要作用32

115、-34。除此之外，一些学者还认为在垂体炎，肝炎，肾炎皮肤病等疾病的治疗中也需要免疫调节的干预，这些临床实验的结果与 CTLA4 对自身免疫的调节作用也是相关联的。四、展望机体的免疫系统是复杂而有序的，当机体的细胞过度活化到一定程度，机体自身必定会分泌某些发挥抑制作用的物质（如CTLA4），使机体的细胞活化维持在一个合理的范围内，使得细胞不至于过度增殖而导致疾病的发生。免疫系统是非常复杂的网络系统，它不但存在着许多的的免疫抑制分子，甚至某些免疫激活华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 48 分子在某些情况下

116、也可以发挥免疫抑制的作用。CTLA4在免疫调节这个网络系统中到底处于一个什么样的位置，它和其他的免疫调节分子还有没有其他作用，比如说协同作用，无关作用，或者还有拮抗作用，除了免疫调节之外CTLA4是否还发挥其他的作用，这些问题还有待于进一步深入的研究。作为另一个例子，CD40传导的信号是活化APC细胞的关键通路。CD40活化导致的抗原提呈细胞功能的提升显示它能与CTLA4发挥的封闭作用一起调节共刺激通路。当前，包括PD-1,OX-40和41BB在内的其他细胞因子超家族也被用于前期临床实验。由于信号通路机制以及细胞因子之间的相互作用都非常复杂，所以我们必须深入对CTLA4和其它负调节因子作用机制

117、的研究，提高对共刺激信号通路作用的认识，以期能为临床治疗提供更多的理论支持。华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 49 参考文献 1. Brunet J F ,Denizot F ,Luciani M F et al . A new member of the immuno- -gloglobulin superfamily CTLA-4J . Nature ,1987 ;328 (6127) :267. 2 Dariavach P ,Mattei M G,Golstein P et al . Human Ig

118、 superfamily CTLA-4 gene :chromosomal localization and identity of protein sequence between murine and human CTLA24 cytoplasmic domains J . Eur J Immunol ,1998 ;18 (12) :1901 3. Balzano C ,Buonavista N ,Rouvier E et al . CTLA24 and CD28 : similar proteins ,neighbouring genesJ . Int J Cancer Suppl ,1

119、992 ;7 :28. 4. Korman AJ, Peggs KS, Allison JP. Checkpoint blockadein cancer immunotherapy. Adv Immunol 2006;90:297339. 5. TeftWA, Kirchhof MG, Madrenas J. A molecular perspectiveof CTLA-4 function. Annu Rev Immunol2006;24:6597. 6. Baroja ML, Luxenberg D, ChauT, et al. The inhibitoryfunction of CTLA

120、-4 does not require its tyrosine phosphorylation.J Immunol 2000;164:4955 7. Schwartz JC, Zhang X, Nathenson SG, Almo SC.Structural mechanisms of costimulation. Nat Immunol 2002;3:42734. 8. Yi LA, Hajialiasgar S, Chuang E. Tyrosine-mediated inhibitory signals contribute to CTLA-4 function in vivo. In

121、t Immunol 2004;16:539-47 9. AlegreML, Frauwirth KA,Thompson CB.T-cell regulation by CD28 and CTLA-4. Nat Rev Immunol 2001;1:220-8. 10. Schneider H, Mandelbrot DA, Greenwald RJ, et al.Cutting edge:CTLA-4(CD152) differentially regulates mitogen-activated protein kinases (extracellularsignal-regulated

122、kinase and c-Jun N-terminal kinase) in CD4+ T cells from receptor/ligand-deficient mice.J Immunol 2002;169:3475-9 11. AlegreML, Frauwirth KA,Thompson CB.T-cell regulation by CD28 and 华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 50 CTLA-4. Nat Rev Immunol 2001;1:220-8 12. Harlin H, Hwa

123、ng KW, Palucki DA, et al. CTLA-4 engagement regulates NF-B activation in vivo. EurJ Immunol 2002;32:2095-104. 13. Krummel MF, Allison JP. CD28 and CTLA-4 have opposing effects on the response ofTcells to stimulation.J ExpMed 1995;182:459-65. 14. WalunasTL, LenschowDJ, Bakker CY, et al. CTLA-4 can fu

124、nction as a negative regulator ofTcell activation.Immunity 1994;1:405-13. 15. Greenwald RJ, OosterwegelMA, van derWoude D,et al. CTLA-4 regulates cell cycle progression during a primary immune response. Eur J Immunol 2002;32:366-73 16. Schneider H, Downey J, Smith A, et al. Reversal of the TCR stop

125、signal by CTLA-4. Science 2006;313:1972-5. 17. Sakaguch i S. N aturally arising CD4+ regulato ry t cells fo r immuno logic selftolerance and negative control of immune respones. Annu Rev Immunol, 2004, 22: 531-562. 18. Taylor PA , Noelle RJ , Blazar BR. CD4 (+ ) CD25 (+ ) immune regulatory cells are

126、 required fo r induction of tolerance to alloantigen via costimulatory blockade. J ExpM ed, 2001, 193 (11) : 13112-1318. 19. Beck KE, Blansfield JA, Tran KQ, et al: Enterocolitis in patients with cancer after antibody blockade of cytotoxic t-lymphocyte-associated antigen 4. J Clin Oncol 24:2283-2289

127、, 2006 20. Salomon B, Lenschow DJ, Rhee L, et al: B7/CD28 costimulation is essential for the homeostasis of the CD4+CD25+immunoregulatory T cells that control autoimmune diabetes. Immunity 12:431, 2000 21 Liu H, Hu B, Xu D, et al: CD4_CD25_ regulatory T cells cure murine colitis: The role of IL-10,

128、TGF-beta, and CTLA4. J Immunol 171:5012-5017, 2003 22 Maker AV, Attia P, Rosenberg SA: Analysis of the cellular mechanism of anti- 华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 51 -tumor responses and autoimmunity in patients treated with CTLA-4 blockade.J Immunol 175:7746-7754, 2005 2

129、3. Kajsa Wing,et al,Shimon Sakaguchi Naturally occurring Foxp3 CD4 regulatory T cells (Tregs) are essential for maintaining immunological self-tolerance and immune homeostasis. Science 10 October 2008:pp. 271 - 275 24. Chambers CA, SullivanTJ, Allison JP. Lymphoproliferation in CTLA-4-deficient mice

130、 is mediated by costimulation-dependent activation of CD4+ T cells.Immunity 1997;7:885-95. 25. Ligers, A., N. Teleshova, T. Masterman, W. X. Huang, and J. Hillert. 2001.CTLA-4 gene expression is influenced by promoter and exon 1 polymorphisms.Genes Immun. 2:145152. 26. Maurer, M., S. Loserth, A. Kol

131、b-Maurer, A. Ponath, S. Wiese, et al. 2002. A polymorphism in the human cytotoxicT-lymphocyte antigen 4 (CTLA4) gene (exon 1 49) alters T-cell activation. Immunogenetics54:18. 27. Chloe L. Thio, Timothy L. Mosbruger,1 Richard A. Kaslow, et al，Cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 gene and recovery from h

132、epatitis B virus Infection，Journal of virology, oct. 2004, p. 1125811262 28. 张亚飞、解俊侠、郜玉峰、沈继龙、李旭。慢性HBV感染者外周血单个核细胞CTLA-4基因多态性与病情转归的关联研究。实用肝脏病杂志，2008，05：297-298. 29. Zhu J , Zou L ,Zhu S ,et al . J . J Neuroimmunol ,2001 ,115 (122) : 111-117. 30 Hodi FS,MihmMC, Soiffer RJ, et al. Biologic activity of c

133、ytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 antibody blockade in previously vaccinatedmetastatic melanoma and ovarian carcinoma patients. Proc NatlAcad Sci US A 2003;100:47127-31. 31. Phan GQ,Yang JC, Sherry RM, et al. Cancer regression and auto- -immunity induced by cytotoxic T lymphocyte-associated

134、 antigen 4 blockade in patients 华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 52 with metastatic melanoma. Proc Natl Acad Sci USA 2003;100:8372-7 32. Guillot C， M athieu P， Coathalem H， et a1 Tolerance to cardiac allografts via local and systemic mechanisms after adenovirus-mediated CT

135、IA4Ig expression JJ Immunol，2000，1 64(1O)：5258 33. Ueda H， Howson JM， Esposito L,et a1,Association of the T-cell regulatory gene CTLA4 with susceptibility to autoimmune disease JNature，2003，423(6939)：506511 34. Serrano NC，MliUan P，Paez MC.Non-HLA associations with autoimmune diseasesJAutoimmun Rev，2

136、006，5(3)：209214 华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文 53 致谢经过艰苦的过程，终于看到论文快要完成的曙光。我谨向两年来和睦相处的各位尊敬的老师、同学、朋友表示衷心的感谢！作为一个工作过的学生再次进入高等学府求学和一直求学的同学心境是很不一样的，我更清楚我缺少什么，我需要什么。在这两年里，我得到了导师陆蒙吉教授的悉心指导，作为导师，他不仅教导我该如何工作和学习，也使我明白了更多做人的道理，这些宝贵财富将使我一生受益。他严谨求实的科学作风，一丝不苟的工作态度，废寝忘食的工作热情，孜孜以求的敬业

137、精神和高尚的个人品格是我学习的榜样。我谨向恩师致以诚挚的谢意！衷心感谢微生物教研室黄汉菊教授和其他老师对我的关心和指导。衷心感谢同济医院临床免疫研究室杨东亮教授、王宝菊等老师给我的大力支持和帮助！感谢于嘉、李磊师兄对我实验的帮助。衷心感谢微生物教研室杨银柯师姐给予我的巨大帮助。衷心感谢张娥娟、江敏、、夏昶、尹莹、张小勇等师姐师兄给与我的帮助和支持。特别感谢我的同学陈扬、吕婷婷、王春还有其他同学对我实验和学习的支持及帮助！还要特别感谢他们对我家人的关心。特别感谢我的各位好友以及室友对我的无私帮助，和他们的友谊是我人生的宝贵财富。我还要感谢父母的鼓励和支持，感谢妻子桂芳多年来的关爱和理解，你们是我努力学习和工作的动力。求学不易，感谢所有曾经关心我、帮助过我的人！谢谢大家！

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