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1、福建医科大学硕士学位论文全方向M型超声心动图时间-运动曲线对1型糖尿病兔早期左室心功能改变的实验研究姓名：谢敏申请学位级别：硕士专业：医学影像与核医学（心脏超声）指导教师：郭薇20100501全方向M型超声心动图时间一运动曲线对I型糖尿病兔早期左室心功能改变的实验研究摘要1、目的1、应用全方向M型超声心动图研究I型糖尿病(DM)兔早期心肌运动改变，为糖尿病心肌病(DCM)的早期珍断提供理论基础和实验依据：2、与常规二维技术比较，探讨两者对评价I型糖尿病左心室功能的应用价值。2、方法96只新西兰大白兔查表法随机各抽出32只，为正常对照组(C)、糖尿病组(DM)及高脂组(HL)，各实验组各随机分成
2、4组，即2周、4周、6周、8周检测组，每组8只。糖尿病兔模型建立采片j耳缘静脉注射进口药四氧嘧啶(80mgkg)，高脂组喂养高脂饲料制造高脂模型(1L)。每组在超声检测后处死取心脏进行HE、MASSON染色及电镜下超微结构观察，取面坝4定脑钠素(NT-ProBNP)、肌钙蛋白(cTnI)及血糖血脂。超声检测：二尖瓣口血流传播速度(VP)、射血分数(EF)、二尖瓣环收缩期峰速(Sa)及组织多普勒(DTI)，全方向M型超声心动图分析：收缩速度达峰时间(TS)、舒张速度达峰时间(TD)。3、结果1、全方向M型心动图：DM组前壁TD、TS分别于第2、4周始出现有意义的延长(P100帧s，配有EchoP
3、AC工作站。M型超声心动图参数的测量及分析采用福州大学生物医学工程研究所研制的LEJ2型全方向M型超声心动图系统。2、试验方法2。1、试验分组及动物模型制作211、试验分组：新话兰白兔(n=96)查表法随机抽出32只，作为F常对照组，32只进行糖尿病(DM)模型复制、32只进行喂养高脂饲料制造高脂模型(IL)。DM组、HL组再查表法随机分为2w、4w、6w和8w四组。A、J下常对照组：普通饲料+普通饮水；B、糖尿病组：普通饲料+普通饮水；C、高脂组：高脂饲料+普通饮水；212、糖尿病兔模型制作所有兔经过适应性喂养1周后丌始实验，对照组给予生理赫水3mL经：耳缘静脉注射。实验组造模前再次称重后，
4、按80mgkg的四氧嘧啶针粉剂(为防止四氧嘧啶氧化，现配现用)溶于生理赫水中稀释为5水溶液，经耳缘静脉快速推入。注射四氧嘧啶溶液后静脉注射5葡萄糠注射液10ml，并24小时内给10葡萄糖注射液作为饮用水，24h后再次更换为普通饮水。开始喂养普通饲料。213、糖尿病兔模型成功的判断标准24小时后连续3天空腹血糖大于167mmollL，空腹血糖稳定5天的实验兔，具有多饮、多食、多尿症状者定为糖尿病模型。214、普通及高脂饲料配方表l兔标准饲料和高脂饲料各营养成分所占比例表2高脂组兔模型高脂饲料原料配方(以lkg饲料计算)高脂饲料成分质量(以lkg饲料计算)兔标准饲料猪油蔗糖胆固醇胆盐051kg02
5、kg028kg001kg25kg22、二维超声图像采集221、于实验2周、4周、6周、8周四个时间点，进行超声心动图检查。检查前l小时予10水合氯醛按lmlkg灌服，使实验兔在检查的过程中保持安静。检查方法：将实验兔仰卧固定于实验台上，剪去心前区、四肢关节处兔毛，连接心电图，待QRS波显示清晰后，行系N-维切面顺序扫查与常规测量，测得左室射血分数(EF)、二尖瓣口血流传播速度(VP)、二尖瓣环收缩期峰值速度(Sa)及DTI的E、A及其比值。显示左室短轴切面二尖瓣及乳头肌水平的切面图像，并记录在超声工作站上。222、启动I。町2型全方向超声心动图系统，将取样线置于左室短轴切而8圈圈囡-一白图4正
6、常对照组时间运动曲线寓墨FjJ一引竺_二_：固5DM组时间运动曲线、kMh露一剖i；F=；i=iiiii=iiiiifiiii确图6IL组时间运动曲线224、阿由两个检测者应用全方向M型，在双盲条件下，对照组左室短轴切面的收缩速度达峰时阳J(TS)、舒张速度达峰时间(TD)进行重复性检验。23、石蜡包埋和切片231、固定：将兔左室心肌标本于4中性甲醛溶液中固定24小时后自来水冲沈6小时。232、脱水：将标本放入梯度酒精脱水(70一80一90一95一100I一100II)各30分钟。233、透明：二甲苯I15分钟一二甲苯IIl5分钟，至标本完全透明。234、浸蜡：将标本浸入混合蜡中置60温箱2小
7、时。235、包埋：将标本的切面与蜡块底面平行包埋于装有液体石蜡的包埋柜中，于室温下自然凝固，修整蜡块。236、切片：用石蜡切片机进行连续切片，厚度511m，于45C温水中展片，分别用普通玻片和多聚赖氨酸防脱玻片捞片后，置于56C温箱中干燥约23小时分别用于HE和免疫组化染色。24、HE染色每一标本取3张切片(普通玻片)作HE染色：241、二甲苯脱腊，蒸馏水冲洗3次，每次3分钟；242、在苏木素溶液中浸泡10分钟，蒸馏水冲洗3次，每次3分钟，取出后在1盐酸酒精中分化5一lO秒钟，立即置入蒸馏水中冲洗；243、在伊红溶液中浸泡15分钟，取出后用蒸馏水冲洗干净；244、经70、95(两次)、100(
8、两次)酒精各l一2分钟脱水，二甲苯透明12分钟，共3次。中性树脂封片，显微镜观察。25、胶原纤维染色(Masson三色染色)步骤251石蜡切片常规脱蜡处理至水：将6tlm切片分别置于松节油(I)5分钟一松节油(II)5分钟脱蜡。后将切片置于梯度酒精(100酒精2分钟一一95酒精2分钟-90酒精2分钟-80酒精2分钟一70酒精2分钟)中，然后用蒸馏水冲沈2min。252滴加l滴(1001t1)Masson复合染色液于切片上染色5分钟。蒸馏水冲掉染液，用蒸馏水冲洗2分钟。253滴加l滴(100ui)5磷钨酸水溶液于切片上媒染5分钟，甩r，显微镜下控制至肌纤维清晰为止。254直接滴加一滴(100u1
9、)苯胺蓝或亮绿于切片上染色5分钟，蒸馏水稍冲。255滴加1滴(100u1)分化液于切片上分化3060秒(2次)。25695酒精分色、无水酒精脱水各2min。257二甲苯I15分钟一二甲苯II15分钟透明，中性树胶封片。26、心肌超微结构电镜观察261、取材：迅速取病程12周的兔左室心尖部组织，切成Imm3大小组织块；262、前固定：3戊二醛一15多聚甲醛一OIMPBS(pH72)4。C数天(2h以上)：263、漂洗：0IMPBS(pH7。2)15分钟X3次：264、后固定：1锇酸一15亚铁氰化钾415小时；265、漂沈：0IMPBS(pH72)15分钟X3次；266、脱水：50酒精10分钟一7
10、0酒精饱和醋酸铀染液4过夜-90酒精10分钟-90酒精一丙酮10分钟一90丙酮10分钟一无水丙酮10分钟X3次：267、浸透：a无水丙酮+坏氧树脂618包埋剂(1：1)15小时，b纯618包埋剂353小时；268、包埋、聚合：3512h，4512h，603天：269、切片、染色：超薄切片机切70-80hm的超薄切片；经醋酸铀、柠檬酸铅分别染色5分钟，并蒸馏水冲洗；2610、在透射电镜下观察并摄片。27、统计学方法：用SPSSl70软件进行统计分析，计量资料用XS表示，符合正态分布的资料多组问均数比较用方差分析，组问两两比较用LSD(方差齐)或DunnettsT3(方差不齐)法进行显著性检验；非
11、正态分布资料多个样本均数间比较用Kruskal-WallisH检验，组间两两比较用Nemenyi法手工计算。12结果多日刁实验过程中DM组共死亡2只，其中2w、8w组各1只，实际完成实验的DM各亚组数量分别为2w组7只，4w组8只，6w组8只，8w组7只。C组、HL组无死亡。对照组新西兰大白兔精神状态良好，反应敏捷，毛色白而光泽。DM组出现多饮、多尿、多食和消瘦等症状，HL组体形增大，活动减少。11、体重：实验术，与对照组相比，DM组体重明显降低(P2，这时常常有不同程度的左心衰竭症状出现14】。由于二尖瓣血流频谱受年龄、心率、心肌收缩力、左室前后负荷等多种因素影响，并存在“假性正常的局限性，
12、故不能靠此单一指标准确评价舒张功能。224多普勒组织成像(dopplertissueimaging，DTI)：心肌纵行纤维附着于二尖瓣环，其收缩、舒张导致二尖瓣环朝向和背离心尖运动。Ea波是舒张早期左室主动松弛，二尖瓣瓣环远离心尖产生的早期舒张速度，Aa波是左房收缩使瓣环再次朝向心室产生的心房主动收缩充盈速度，Ea减低主要反映患者左室松弛速度减慢，EaAa减低是患者左室舒张功能减低的一个指标。225舒张期二尖瓣血流播散速度(Vp)：于心尖四腔心切面，M型取样线通过二尖瓣流入区的中央，连接任意从二尖瓣到心尖部的等速线的斜率即代表心室血流扩散速度(Vp)。VP是估测左室舒张功能的减退的一个独立指标
13、，不受前负荷的影响。VP越小，左室舒张功能减退的程度越重。23、左室收缩功能的评价231射血分数(EF)：为每搏排血量占舒张期末心室容积的百分比。心脏的大小、个体的差异，以及心率快慢等，对EF值影响较小，因而它是反映左室泵血功能的敏感指标。1型糖尿病患者行超声心动研究提示舒张功能异常，表现为舒张早期充盈、心房充盈、等容舒张范围降低【”】，这可能是糖尿病心肌损伤在普通二维最早的征象，随着疾病的进展才逐渐出现收缩功能不全。因此，糖尿病病人射血分数(EF)下降，意味着进入糖尿病性心肌病(DCM)的较晚期，此时再诊断及治疗，势必错过最佳时机。232短轴缩短分数(FS)：FS是反映心肌收缩力较敏感的指标
14、，当左心室容量负荷过重，室间隔动度增大，但本身增厚不明显时，EF值可高估，此时FS可较好的评价心肌收缩功能。233二尖瓣环收缩期峰值速度(Sa)：将组织多普勒取样容积置于二尖瓣环的位置，测量二尖瓣环的收缩期峰值速度，即为Sa，Sa波是心室收缩使瓣环向心尖运动产生的收缩速度，能够准确评价左心室长轴收缩功能。Sa的大小跟与左室射血分数具有较高的一致性。综上所述，普通二维超声可以对糖尿病患者心脏的形态和舒缩功能做出测定和评价，但一般局限于病程的较晚期，且受到病人体形、年龄、性别等因素的影响，存在结果“假性正常化”，故无法完全满足临床上“早期发现、早期治疗”的需求。随着计算机技术的进展及相关软件的完善
15、，涌现出许多先进的技术，弥补普通超声技术的不足，如应变率和应变率成像(SRI)的出现，有研究发现普通二维超声检测结果阴性的糖尿病患者室壁各阶段心肌SRs(收缩期峰值应变率，是反映心肌收缩速度的一个指标)均明显降低，SRe(舒张早期峰值应变率，反映心肌弛缓性的指标)减低，所以SRI可以在左室整体舒缩功能出现异常之前即可敏感地检测出局部心肌组织的舒缩功能异制16】。三维超声心动图(3DE)继B型超声成像技术出现后医学诊断技术的又一次巨大变革，其测定心室容积均不依赖几何假设，而是从心室整体采集数据，根据心室实际几何形状测量计算容量及各项心功能参数，因而在心腔变形、节段性室壁运动异常等病理状态下也可获
16、得准确结果【171。24全方向M型超声心动图亦称为改进的解剖M型超声心动图，是一种从超声心电图序列图像L，提取一种新运动信息的新方法。其最人特点是可以在同一心动周期对不同部位的心肌运动进行任意多条运动曲线的同步成像，能同时同步记录下心脏内任意结构多个心动周期的M型超声图像，同时减少角度与时间不一致产生的误差【18】。一幅全方向M型心动图中可以同时包含多条反映不同室壁部位运动信息的运动曲线，在代表每个室壁的每条取样线上，可以蕴含大量的信息，比如心肌内外膜运动速度、加速度、速度达峰时间等，与同步的心电信号作时间基准，对这些信息加以分析，对局部整体的心肌状态乃至整体的心脏功能可以做出评价，比如利用全方向M型超声心动图对左心室各节段室壁的
