含小檗碱类中药品质生物评价与控制初步研究

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1、成都中医药大学 硕士学位论文 含小檗碱类中药品质生物评价与控制的初步研究 姓名：方艺霖 申请学位级别：硕士 专业：药物化学 指导教师：张艺；肖小河 2008-05 成都中医药大学硕士学位论文 1 摘 要 中药质量的评价和控制一直是中药现代化研究的难点和热点，现行的“成分论”中 药质量评价模式和方法，不仅难以有效地控制中药的质量，更难以反映其有效性和安全 性。为寻求解决中药质量评价和控制问题的新突破，本文以临床常用且物质基础相对明 确的含小檗碱类中药为模式药，借鉴生物制剂质量管理模式，探索建立以生物评价为核 心手段的中药品质评价模式与方法，以补充和完善现行的中药质量评价与控制体系。 目的： 本研

2、究探索建立以生物评价为核心手段的含小檗碱类中药品质评价方法， 以补充和 完善现行的中药质量评价与控制体系。 方法： 1. 采用 RP-HPLC 法，对比分析了黄柏、关黄柏、黄连和三颗针样品中小檗碱等三 种生物碱类成分含量并建立化学指纹图谱。 2. 采用管碟法和生物热动力学法对比考察含小檗碱类中药抗菌活性的差异性， 初步 建立基于管碟法和生物热动力学法的中药抑菌效价检测方法。 结果： 1. 生物碱类成分含量测定和化学指纹图谱能客观表征含小檗碱类中药化学特征信 息的差异性，在此基础上建立了其化学品质模式识别方法，结果表明化学特征信息在一 定程度上能较好地用于含小檗碱类中药的品质评价和控制。 2.

3、参照物盐酸小檗碱和供试品含小檗碱类中药在一定浓度范围内， 其剂量与抑菌圈 直径 D 及第二指数生长期达峰时间 T2max呈现良好的量效关系（r0.99） ，说明管碟法和 生物热动力学法可作为客观有效的效价检测手段用于含小檗碱类中药的生物评价和控 制。 暂定黄柏、 关黄柏、 黄连和三颗针药材生物效价下限值分别为 70U/g、 15U/g、 440U/g 和 30U/g，可信限率不得超过 10%。 3. 综合分析试验结果的关联性，分别进行了化学组分信息-生物效价信息、生物效 价信息-生物效价信息的相关性分析，结果显示：指标成分与生物效价信息表达之间存 在较为显著的正相关关系（相关系数r0.8517

4、，P0.05） ， 说明 S 和 T 呈平行直线关系，可用量反应平行线法的（33）法检测供试品效价。 效价计算和实验误差估计 Sm= 0.012868，测得效价 PT=5.7925U/ml，PT的可信 限率为 FL=6.1824%，PT的可信限范围为 5.56736.2835U/ml。而每 1ml 供试品储备液 相当于 60mg 黄柏药材， 故黄柏药材的效价 PT= 5.7925U/60mg= 96.54U/g， 即每 1 g 药材 约相当于 96.54U 化学标准物质盐酸小檗碱的 D 值表达效应，可信限率（FL%）为 6.1824%。 6.2 关黄柏样品对金黄色葡萄球菌作用的（33）法效价检

5、测 取制备好的双碟 6 个， 在每一双碟中间隔的 3 个牛津杯中分别滴装高 （S3） 、 中 （S2） 、 低（S1）浓度的盐酸小檗碱标准品溶液；其余 3 个牛津杯分别滴装相应的高（T3）、中 （T2）、低（T1）浓度的关黄柏 G-12 样品供试品溶液，加样量均为 0.3ml。于 37 培 养箱中培养 15 h 后，用游标卡尺测量各个抑菌圈直径，结果见表 3-9。 表 3-9 关黄柏样品和盐酸小檗碱对金黄色葡萄球菌作用的生物效价试验数据表 Table 3-9 The biopotency measurement data with Cortex Phellodendri Amurene and

6、 Staphylococcus aureus Dose T（mg/ml） S（g/ml） dT1(31) dT2(39) dT3(49) dS1(114) dS2(143) dS3(179) D(mm) 16.00 16.92 18.10 16.14 17.16 18.18 15.88 17.10 18.02 16.00 17.02 18.30 16.12 17.16 18.28 16.20 17.18 18.40 15.90 16.90 18.40 15.92 17.22 18.20 15.80 17.00 18.24 15.98 17.02 18.00 15.80 17.10 18.44

7、16.00 17.00 17.94 使用生物检定统计程序 BS2000 版中的（33）法进行可靠性测验和效价计算和试验 误差估计等，结果如下。 可靠性检验 同本节 6.1 项下。 效价计算和实验误差估计 Sm= 0.0038606，测得效价 PT=1.4993U/ml，PT的可信 限率为 FL=1.8128%，PT的可信限范围为 1.47011.5245U/ml。而每 1ml 供试品储备液 相当于 60mg 关黄柏药材，故关黄柏药材的效价 PT=1.4993U/60mg= 24.99U/g，即每 1 g 成都中医药大学硕士学位论文 46 药材约相当于 24.99 U 化学标准物质盐酸小檗碱的

8、D 值表达效应，可信限率（FL%）为 1.8128%。 6.3 黄连样品对金黄色葡萄球菌作用的（33）法效价检测 取制备好的双碟 6 个， 在每一双碟中间隔的 3 个牛津杯中分别滴装高 （S3） 、 中 （S2） 、 低（S1）浓度的盐酸小檗碱标准品溶液；其余 3 个牛津杯分别滴装相应的高（T3）、中 （T2）、低（T1）浓度的黄连 H-18 样品供试品溶液，加样量均为 0.3ml。于 37 培养 箱中培养 15 h 后，用游标卡尺测量各个抑菌圈直径，结果见表 3-10。 表 3-10 黄连药材和盐酸小檗碱对金黄色葡萄球菌作用的生物效价试验数据表 Table 3-10 The biopoten

9、cy measurement data with Coptis Chinensis and Staphylococcus aureus Dose T（mg/ml） S（g/ml） dT1(0.006) dT2(0.008)dT3(0.010)dS1(114) dS2(143) dS3(179) D(mm) 15.00 16.20 17.60 15.02 16.28 17.90 14.80 16.38 17.76 15.00 16.10 17.78 15.10 16.50 17.46 14.92 15.98 17.66 15.00 16.30 18.00 14.90 16.78 17.90 15

10、.02 16.28 17.90 15.00 16.28 17.86 15.56 16.80 17.80 15.20 16.76 18.04 使用生物检定统计程序 BS2000 版中的（33）法进行可靠性测验和效价计算和试验 误差估计等，结果如下： 可靠性检验 同本节 6.1 项下。 效价计算和实验误差估计 Sm= 0.0051651，测得效价 PT=36.4150U/ml，PT的可 信限率为 FL=2.4573%，PT的可信限范围为 35.954037.7430U/ml。而每 1 ml 供试品 储备液相当于 60mg 黄连药材，故黄连药材的效价 PT= 36.4150U/60mg= 606.9

11、2U/g，即 每 1g 药材约相当于 606.92U 化学标准物质盐酸小檗碱的 D 值表达效应，可信限率 （FL%）为 2.4573%。 6.4 三颗针样品对金黄色葡萄球菌作用的（33）法效价检测 取制备好的双碟 6 个， 在每一双碟中间隔的 3 个牛津杯中分别滴装高 （S3） 、 中 （S2） 、 低（S1）浓度的盐酸小檗碱标准品溶液；其余 3 个牛津杯分别滴装相应的高（T3）、中 （T2）、低（T1）浓度的三颗针 S-23 样品供试品溶液，加样量均为 0.3ml。于 37 培 养箱中培养 15 h 后，用游标卡尺测量各个抑菌圈直径，结果见表 3-11。 表 3-11 三颗针药材和盐酸小檗碱

12、对金黄色葡萄球菌作用的生物效价试验数据表 成都中医药大学硕士学位论文 47 Table 3-11 The biopotency measurement data with Radix Berberidis and Staphylococcus aureus Dose T（mg/ml） S（g/ml） dT1(0.125) dT2(0.155)dT3(0.195)dS1(114) dS2(143) dS3(179) D(mm) 16.12 17.10 18.68 16.42 16.88 18.44 16.40 17.10 18.24 16.20 17.38 18.36 16.18 17.12 1

13、8.18 16.20 17.14 18.20 16.32 17.90 18.90 16.30 17.56 18.88 16.44 18.10 18.80 16.32 17.66 18.64 16.28 17.46 18.66 16.40 18.02 18.78 使用生物检定统计程序 BS2000 版中的（33）法进行可靠性测验和效价计算和试验 误差估计，结果如下： 可靠性检验 同本节 6.1 项下。 效价计算和实验误差估计 Sm= 0.0085975，测得效价 PT=1.865U/ml，PT的可信 限率为 FL=4.0253%，PT的可信限范围为 1.78281.933U/ml。而每 1 ml

14、 供试品储备液 相当于 60mg 三颗针药材，故三颗针药材的效价 PT= 36.415U/60mg= 31.08U/g，即每 1 g 药材约相当于 31.08U 化学标准物质盐酸小檗碱的 D 值表达效应，可信限率（FL%）为 4.0253%。 6.5 含小檗碱类中药样品的抑菌效价检测结果 取不同产地黄柏、关黄柏、黄连和三颗针样品，配制成供试品溶液，在上述既定的 检测方法和条件进行生物效价检测。结果见表 3-12。 表 3-12 含小檗碱类中药样品生物效价检测结果 Table 3-12 The result of biopotency measurement 样品编号 效价 P（U/g） 可信限

15、率（FL%）样品编号 效价 P（U/g） 可信限率（FL%） C-1 176.97 2.6689 G-9 24.36 6.6863 C-2 94.77 2.4226 G-10 30.43 5.3112 C-3 77.93 4.9322 G-11 27.09 6.0993 C-4 97.87 2.5634 G-12 24.99 1.8128 C-5 96.54 6.1824 G-13 26.87 3.0280 C-6 82.75 4.9176 G-14 24.64 3.1466 C-7 73.29 4.2914 G-15 17.94 5.1981 C-8 94.72 2.7807 G-16 18

16、.98 1.6086 H-17 450.67 1.7142 S-23 31.08 4.0253 H-18 606.92 2.4573 S-24 32.21 1.8170 H-19 465.97 2.9165 S-25 33.63 3.0615 H-20 650.08 3.8406 S-26 34.62 3.8066 H-21 447.57 1.8492 S-27 32.02 2.0857 H-22 498.78 2.0912 S-28 30.34 1.8453 成都中医药大学硕士学位论文 48 7 小结 本部分应用管碟法对不同产地的黄柏、关黄柏、黄连和三颗针样品的抑菌效价进行 了抑菌效价的检测。试验结果均能通过可靠性检验，说明含小檗碱类中药可以使用量反 应平行线法的（33）法进行供试品效价计算和试验误差估计；从检测结果可以看出，不 同产地黄柏、关黄柏、黄连和三颗针样品的抑菌效价差异明显，其中黄连样品的抑菌效 价最高，关黄柏和三颗针样品抑菌效价较低。因此，根据上述分析结果制定了含小檗碱 类中药抑菌效价限量标准，暂定每