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1、18l3G85河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。：否则，承担相应的法律责任。研究生虢彳懈新撼猢二级学院领导虢御7叫哞莎月宫日J河北医科大学研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导
2、教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研究生签名：小寥枉跨导师签章研Ijl年万月8日中文摘要英文摘要英文缩写研究论文1Lj-刖吾材料与结果，7Hl、附图、讨仑28结论32参考文献33综j态36致谢”49个人简历50中文摘要兔腹主动脉球囊损伤后IL-8对VSMCs增殖的影响摘要经皮冠状动脉腔内成形术(pereutaneoustransluminalcoronaryangioplasty，PTCA)是治疗冠心病安全、有效的方法，但术后36个月再狭窄发生率达3050，严重影响其远期疗效。再狭窄的发生机制至今尚未完全阐明。目前，大多数学者认为血管平滑肌细胞向内膜下迁移并过度增殖是其关键环
3、节之一，因此血管平滑肌细胞增殖的调节成为研究的焦点。一些研究资料显示球囊损伤后血管再狭窄与血管弹性回缩、血栓的形成和机化，血管平滑肌细胞(VSMCs)过度增殖及细胞外基质的聚集等有关。其中VSMCs的过度增殖可能是再狭窄形成的主要原因，对血管进行球囊扩张后，血管内皮和中膜平滑肌细胞受到牵拉、损伤，在修复过程中在一系列生长因子的刺激作用下，VSMCs过度增殖、并向内膜方向迁移。因而抑制VSMCs过度增殖以防治再狭窄成为广大医务工作者关注和研究的课题。白细胞介素8(Interleukin8，IL8)是趋化因子CXC亚家族的一员，主要由单核细胞产生，其主要生理活性是趋化和激活中性粒细胞并分泌大量的黏
4、附分子，使中性粒细胞表面CDllbCDl8受体上调。IL8可以诱导平滑肌细胞的增殖和迁移，是一个促血管生成因子，在炎症反应过程中起着重要的作用。IL8能促使单核细胞在内皮细胞上的滚动转变成强有力的黏附。研究发现，升高的IL8水平与冠状动脉疾病的发病有关，并且可以作为心脏事件的预测因子。目的：本研究通过球囊扩张拉伤兔腹主动脉，建立动脉再狭窄模型，造影检查腹主动脉管腔狭窄变化情况，采用组织病理观察血管球囊扩张术后内膜和中层平滑肌的结构改变，利用免疫组化技术观察IL一8蛋白阳性表达和PCNA阳性表达细胞数，研究IL一8对血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响，为防治PCI术后再狭窄提供可靠的理论依据
5、。方法：选择雄性新西兰大白兔24只为实验对象，体重250325kg，由河北医科大学实验动物中心提供。以上实验动物随机分为实验组(experimentgroup)、治疗组(treatmentgroup)和假手术组(shamgroup)，中文摘要每组各8只动物。实验组和治疗组动物通过穿刺股动脉，送入球囊拉伤腹主动脉。治疗组动物通过耳缘静脉注射IL8单克隆抗体进行干预。假手术组动物只进行股动脉穿刺和留置鞘管，不进行球囊扩张拉伤。1分别于实验前，实验后4小时、1天、3天，1周、2周、4周，耳缘静脉采血4ml，检测三组动物血清IL8水平。2术后4周时处死动物进行病理组织学检查，应用光学显微镜和计算机病理
6、图象分析系统分析测定以下指标：内膜中膜厚度、面积，计算血管狭窄程度(邻近正常血管管径狭窄段最小管径)邻近正常血管管径1。3利用免疫组化染色技术观察IL8蛋白表达情况，增殖细胞核抗原PCNA染色分析后，用光学显微镜和计算机病理图象分析系统测定每40倍视野中PCNA阳性细胞比例，计算阳性细胞数和阳性细胞百分率。结果：1三组实验动物之间体重、月龄、血脂等一般情况比较，差异无统计学意义(尸O05)。2术前IL8水平比较，实验组、治疗组、假手术组三组之间无明显差异，实验组动物球囊损伤4小时后IL8水平即开始升高，术后1d达到峰值，持续增高4周，且明显高于治疗组和假手术组。治疗组和假手术组动物IL8水平无
7、上述变化规律。3实验组动物腹主动脉明显狭窄，组织学检查内膜面积和中膜面积、血管狭窄程度等指标大于治疗组和假手术组(氏O01)，治疗组管腔有所狭窄，假手术组动物管腔无明显变化，治疗组与假手术组无显著性差异(胗O0S)。相关分析显示，IL8水平与内膜厚度、内膜面积、中膜厚度、中膜面积等呈正相关(相关系数r分别为O905，0897，O852，O846，P均Hoov争卜N式一刊一西8n吨”H州nNI卜n昏0H干乙c寸。吼卜NN卅n寸N卜吨小州N口I心Nn6H州nn0寸心0H刊n甙18nN冀HN州甙卜qo一书卜一心NH卜H卅岔n卜卜扒8刊NNcD寸D6州HNH口昏NH刊寸o卜HnNH州寸n蚕二_IIo熏
8、2Q暑岭NNWN8nH善HA寸N州n节心寸H。言寸心N州寸n寸一譬N6N卅崎9寸Hoq卜0n州N9”H磊N心nH州n卜西n0H州一冀n岭篇gIlID4)(田们鼍Qp事寸譬DD、-7r_o辇二言屯n蠢它HJnoII寸20Jo【S州k畜cI；盆nIIIs甚一oQDuIp甚2盘皇勺瓮厂IHo一ooD巨ND一皋工州帛谋奄摹供辎S要i蒌巴Hoov奠c15)JM_II砖二一oov乒宝N寸I刊nNqB寸HH千9C寸们卅kvCljooD皇_II一2暑。若拐一Q们oJo口o一每cIIuou留一D届卜喇帛昧奄nH0刊寸。謇I；l研究论文讨论自Gruentzig等于20年前首次报道用用经皮腔内冠状动脉成形术(per
9、-cutaneoustransluminalcoronaryangioplastyPTCA)治疗冠状动脉狭窄性疾病以来，PTCA作为治疗缺血性心脏病的一个重要方法，现已在世界范围内广泛使用。但术后36个月再狭窄发生率达3050【11，严重影响其远期疗效。再狭窄的发生机制至今尚未完全阐明。大多数学者认为再狭窄类似一般的损伤愈合过程，是目标血管对介入治疗损伤的愈合反应，包括血管弹性回缩、血管重塑、血栓形成和机化以及血管中层平滑肌细胞活化、增殖、迁移并分泌细胞外基质导致的内膜增生等多个相互独立又互相影响的过程【4】。研究表明【67】，炎性反应在上述过程中起重要作用。其中，内膜增殖学说曾是研究的主要方
10、向，但大多数抑制内膜增殖的药物，虽然在动物模型取得良好效果，但在临床使用中却不能预防和降低再狭窄的发生【8】，因此血管平滑肌细胞的增殖成为研究的焦点。目前，血管内皮损伤诱发的VSMC大量增殖及向内膜迁移而引起的内膜增生被认为是PTCA术后再狭窄的主要病理机制【9。111。术后再狭窄是经皮腔内冠状动脉成形术及血管支架植入后主要的远期不良反应，再狭窄的机制较复杂，但血管壁增生性重塑是主要机制之一，在血管壁增生性重塑过程中，血管平滑肌细胞大量增生，同时出现细胞凋亡，当细胞增生过度，凋亡不足时，血管壁细胞总量及其合成的细胞外基质构成肥厚的血管壁【121。内膜增殖的机制一般认为系血管内皮细胞和中膜对损伤
11、的过度修复反应。方宁远等【l3】观察兔髂动脉内皮损伤后平滑肌细胞增殖的过程，发现在血管成形术后2472小时，血管平滑肌细胞开始增殖，S期、G1期和M期细胞数增加，术后2-4周达到高峰，6周后不再增加，但部分血管增殖期细胞仍可维持在较高水平。Schwartz14对尸检和旋切术所获标本进行病理学观察，发现PTCA术后再狭窄新生内膜中，细胞成分仅占11，而细胞外基质占89。国内姚玉宇等【15】用5F动脉导管损伤兔腹主动脉，发现内膜损伤后2周内以VSMC增殖为主，在基质形成的参与下形成血管狭窄，4周后则以基质增殖为主。因此，细胞外基质的过量分泌和积累也是内膜增厚的重要原因。细胞外基质分子通常在内皮细胞
12、损伤后24-一研究论文48小时即可表达，并出现在血管的中层和外膜，2周后则主要集中到新生内膜的表层，然后逐渐积累在新生内膜的内层，成为增厚内膜的主要成分06O平滑肌细胞增殖过程大体可分为4个不同阶段【161；血管中层平滑肌细胞表型改变，进入增殖周期：内皮损伤后24小时内，受损伤局部聚集的细胞因子和生长因子的刺激，血管中层个别区域的平滑肌细胞即由分化状态转变为去分化状态(即由收缩型转变为合成型)，并进入增殖周期(约占细胞总数的1-2)，开始增殖。平滑肌细胞向内膜下迁移、增殖：内皮损伤后72小时内，一些增殖的中层平滑肌细胞开始通过内弹力膜的网状孔隙向内膜下迁移。这部分细胞的半数还可进一步增殖，成为
13、内膜下层的主要细胞，而其余的细胞则不再增殖，占内膜细胞成分的10。基质积聚期：此期平滑肌细胞凋亡与增殖持平【17】，细胞数目基本维持不变，但细胞体积增大，合成能力增强，可分泌大量胶原和细胞外基质，加重内膜增厚和管腔狭窄。再增殖期：在各种促分裂因素的持续刺激下，内膜下静止的平滑肌细胞可再度进入增殖周期而发生增殖，加重内膜增殖及管腔狭窄。大量临床和动物实验已证明，PTCA术后SMC的增殖和迁移是造成再狭窄的主要机制之一。病理学上，再狭窄病变含有较多的纤维成分，脂质较少，显示明显的纤维细胞增殖，采用免疫细胞化学方法和对平滑肌特异的Q肌动蛋白染色法对再狭窄的活检组织进行分析，证明这些细胞为血管平滑肌细
14、胞。它们是增值的新生内膜的主要成分，约占细胞总数的888t18】。SMC主要分布在血管壁的中膜，少量分布在血管内膜，具有合成型和收缩型两种类型，正常情况下血管内的SMC为收缩型并受内皮的保护。内皮细胞通过形成屏障与SMC形成异类细胞连接和分泌类激素样物质而保持SMC的收缩型，内皮细胞损伤或剥脱后，血小板粘附聚集，大量的血管活性物质释放，促使SMC由收缩型转化为合成型。合成型SMC除分裂增殖及合成细胞基质外，还可通过自分泌和旁分泌产生多种生长因子(如IL1、TNF、PDGF、FGFs等)。刺激自身和邻近的SMC进一步增殖，形成自我维持增殖机制。损伤后34天，处于增殖状态的SMC中有30开始逐渐由
15、中膜向内膜迁移，迁移在第一周最明显。到510天，迁移至内膜的SMC开始以1-5的速度缓慢增殖，持续数周至研究论文数月，6个月后内膜中的SMC全部转变成收缩型，数量逐渐减少。目前认为，中膜SMC增殖是对损伤和SMC坏死的直接反应，对以后是否发生再狭窄影响不大。而迁移至内膜的SMC数量、增殖速率和增殖持续时间是发生再狭窄的主要原因【191。实验证明，血管成形术后损伤部位有局灶性出血和内膜微血栓形成，而这些部位内膜的SMC复制率最高，提示SMC增殖与血栓形成之间有内在联系【201。IL8为趋化因子超家族中的一员，是1987年Yoshimur首次从脂多糖(LPS)及植物血凝素(PHA)束U激的人血单核细胞血清中纯化出的种对中性粒细胞有趋化作用的蛋白质，它是人类发现的的第一个趋化因子，当时被命名为单核细胞衍生的中性粒细胞趋化因子(MDNCF)。1988年12月，在嗜中性粒细胞因子国际会议上将其命名为IL一8NAF1。同年Matsushima
