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1、流式细胞仪标本处理一般原则及方法,流式细胞仪使用一般方法及技巧,临床流式细胞仪应用简介,殷跃锋,流式细胞仪原理介绍,双光源系统流式细胞仪,在管道大约50倍直径距离处，鞘液中心速度与边缘速度达到稳定，形成稳定的层流。,样本与鞘液未入管道时，边缘与中心速度一致。,进入管道后，受管壁粘性阻力边缘速度下降，中心速度不变。,流体形成层流后，会产生流体聚焦效应，所有颗粒均被推致流速最快的液流中。,颗粒以衡定的速度作匀速运动。,无论每秒检测数量为多少，颗粒经过检测区的速度是衡定的,流式细胞仪标本准备 染色的一般原则及方法,标本来源： 外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他。,根据各种具体实验，选用不
2、同的抗凝剂。 可用的抗凝剂如下：,EDTA： 2mg/ml 枸椽酸钠：0.38% 肝素：15IU/ml,标本处理时间：,新鲜样本分析时，样本采集后应立即分析,样本固定方法： 1%的多聚甲醛或75%的酒精，作用30分钟。 注：不同的实验，所用的固定方法不完全相同。,样本处理标准试剂：,一、10%Bovine Serum Albumin BSA,1. 溶解10g BSA至100ml蒸馏水中,2. 4C，20000 g离心30分钟,3. 分装后-20C保存,二、0.1% BSA-PBS缓冲液,1. 准备500ml，PH7.3 PBS,2. 加入5ml 10% BSA,3. 使用0.45um滤网过滤,
3、三、氯化铵溶血剂,1. 在一升蒸馏水中溶解8.29g NH4CL,1g KHCO3和37mg Na2EDTA,2. 调节PH值至7.2,3. 在使用前配置该溶血剂，并用0.45um滤膜过滤,方法一：溶血法,取100 ul抗凝全血；,2. 快速加入 2ml NH4CL溶血剂,混匀；,3. 室温孵育10分钟；,4. 4C，400g离心10分钟。去上清，加入2ml BSA-PBS；,5. 4C，400g离心10分钟。去上清，加入2ml BSA-PBS；,6. 4C，400g离心10分钟。去上清，调整细胞浓度至5x106/ml。,富集白细胞,注：化学试剂直接作用于红细胞的溶血剂有：以草酸为主的溶血剂（
4、Coulter Q-Prep），基于NH4CL的BD公司的FACSLyse溶血剂。,优点：溶血时间快？，在流式细胞仪上可清楚地将淋巴、单核、粒及红细胞碎片相区分。,缺点：需严格掌握溶血时间，对白细胞表面抗原有影响，随时间细胞形态变化大。,方法二：密度离心法提取单个核细胞,Histopaque 1077为Ficoll与Sodium diatrizoate(泛影酸钠)混合物，其密度为1.1191.077。通过离心可将全血中的粒细胞与单个核细胞分离。粒细胞沉积于1.1191.077的血浆层，而单个核细胞则在1.077以下的血浆层中。,1. 准备2ml抗凝血（根据实验要求确定用血量）， 等量PBS稀释
5、；,2. 准备1ml Histopaque 1077 (Sigma)；,3. 室温下700g离心30分钟；,4. 仔细将含有单个核细胞血浆层吸出；,5. 加4ml BSA-PBS，400g离心10分钟；,6. 加2ml BSA-PBS清洗2次。,操 作,淋巴节、扁桃体、脾、胸腺等淋巴组织由于结构松散，容易分离成单个细胞。一般对样本进行切剪、研磨、过滤便可。,从组织获取淋巴细胞,将样本置于陪替氏培养皿，加入15ml BSA-PBS； 将样本切成3-4mm3大小，用镊子将其分离； 将样本经滤网过滤，用密度法分离、提纯淋巴细胞。,方 法：,其他标本：通常在其他组织中分离淋巴细胞需用酶进行消化。对于不
6、同标本，处理方法也各不相同。,制备大鼠肾脏浸润细胞,解剖刀、CO2孵育箱、滤网 以及含1mg/ml胶原酶的细胞培养液（无血清）,材料：,方 法：,1. 将样本置于皮氏培养皿，用解培刀切成小块；,2. 加入10ml胶原酶溶液，37C CO2培养箱孵育30分钟；,3. 滤网过滤；,4. 密度梯度法离心提纯淋巴细胞。,其他类型细胞,在组织中提取细胞通常使用酶消化法。同样对于不同组织处理方法也各异，以下是讲述通用的胶原酶消化法制备组织细胞。改良后的此法尚可用于制备人、鼠上皮细胞。,材 料,解剖刀 0.15%胰蛋白酶 Hankss缓冲盐或PBS，pH7.3 不含Ca、Mg离子的HBSS II型胶原酶 1
7、%BSA或5%FBS 5ml的吸样管 35um尼龙滤网 DNase,将样本置于皮氏培养皿，加15ml BSA-PBS，将样本切 成1mm3大小，用镊子将其分离； HBSS或PBS洗清 加入10ml无Ca、Mg离子0.2% II型胶原酶溶液0.02% DNase 1的HBSS； 37C摇床上孵育1560分钟，视样本类型而定；,操 作,用5ml的吸样管反复吹打，制成单个细胞悬液； 使用35um滤网过滤，300g离心5分钟； 用PBS或细胞培养液重悬样本；对于某些样本过滤后仍有小块组织，重复第5步获取细胞，重复第7步； 用含0.15%胰酶、0.02%DNase 1不含Ca、Mg的HBSS重悬， 37
8、C孵育一段时间加入1%BSA或5%FBS，灭活酶活性。,细胞培养,许多原代细胞和培养细胞系，都为贴壁型生长。通常先用胰酶处理获得单细胞悬液，需注意消化过度会损害细胞，特别是改变其表面抗原标记。 准备单细胞悬液 1.仪器和试剂： 0.25%r EDTA,pH 7.2 0.25% 的胰酶 10%血清的培养液 2.方法： a. PBS洗涤细胞； b. 加入0.25%有胰酶，37C处理28分钟； c. 倒置显微镜下观察，至大部分细胞脱落悬浮后，加入含10%血清的培养液。 d. PBS液洗涤细胞，最后配成终浓度为1106/ml 的细胞悬液。,样 本 处 理,抗体染色一般方法,外周血白细胞分析：100ul
9、全血 血小板分析：15ul全血（根据样本血小板数量） 红细胞分析：1ul全血（根据样本中红细胞数稀释后使用） 骨髓：100ul 其他样本，计数后决定使用体积,目标细胞数量及检测终浓度：1106/ml,细胞计数方法,传统手工计数：耗时、准确度差 流式细胞仪计数： BD，Coulter仪器：高速4ul/秒，中速2ul/秒，低速0.5ul/秒？ partec仪器:最为精密的细胞计数器，直接报告细胞浓度,反应体积,样本中加完抗体后， 1106细胞反应体积应不小于100ul。,抗体染色,最为普通的抗体染色原则： 1106细胞对1 ug 抗体（抗体供应商所推荐使用单位），此浓度90%处于过饱合状态 精确使
10、用：滴定抗体，抗体对于抗原恰达到饱合浓度,SPECIFIC ANTIBODY,NON-SPECIFIC ANTIBODY,CONCENTRATION,AMOUNT BOUND,抗体滴定原理,流式细胞仪抗体滴定方法,孵育、溶血、固定,抗体孵育：室温下避光15分钟（某些情况下如：细胞内因子检测需冰育） 溶血：如样本含中有红细胞需溶血（见下页） 样本溶血后需立即上机检测，固定后可放置较长时间,白细胞保护型溶血剂Cal-Lyse(其中已含细胞固定剂)：,1，100ul外周血，加入100ul溶血剂,2，混匀后，室温下孵育10分钟,3，加入2ml蒸馏水，混匀后室温下孵育10分钟,4，根据实验需要，免洗直接
11、上机检测或400g离心10分钟后PBS重悬,优点：试剂为温和型溶血剂，不影响细胞表面抗原及溶血时间无需精确把握,各溶血剂性能比较,抗体标记荧光素及其他荧光染料,荧光激发及发射原理,能量级,能量损失,标记抗体常用荧光素 FITC,激发光：488nm 发射光：525nm;使用面最广，价格便宜,Alexa Green具有更佳的能量转移效率及更纯的发射光谱,PE,激发光488nm 发射光575nm 此荧光的激发效率最佳，故此荧光得到的信号最强 检测某些弱表达的抗原，推荐使用此荧光素 价格较FITC昂贵,PE-Cy5 TC,激发光488nm, 发射光667nm,为复合荧光素，荧光激发较率较高，信号强,F
12、TIC、PE、PE-Cy5三者为流式细胞最为常的荧光，并经常将三者共同使用进行三色分析,PE-Cy7,激发光488nm， 发射光767nm 为复合荧光素，2000年后被开发出来，激发效率佳 与前三者联进可进行单激光四色分析（488nm），光谱之间影响较小,APC,激发光633nm， 发射光660,在配有双激光的流式细胞仪上，此荧光染料与FITC、PE、PE-Cy5联用做四色分析。但现在因单激光四色可实现，故使用该染料意义不大。,核酸染料,细胞膜电位、离子、脂类探针,现已发现或开发出来了各种细胞膜电位、各类离子、pH值、脂类探针，运用这些探针在流式细胞仪上可轻易检测各种细胞功能，可实现一些异想不
13、到的效果。 详细信息，见细胞探针公司网站： www.molecularP,与流式细胞仪相关的荧光术语,MESF（Molecules of equivalent soluble fluorochrome）等量可溶性荧光分子：国际标准单位，用来衡量荧光强度 自发荧光：细胞或颗粒在激发照射下会发出各种波长的荧光。白细胞自发荧光强度为6501150MESF，血小板及其他颗粒自发荧光更低 流式细胞仪精度：分析白细胞要求精度在1000MESF以内，分析其他细胞或颗粒需要更高的精度：300MESF以内,第二部分,流式细胞仪使用一般方法及技巧,上机检测,样本染色及溶血过程处理完后应立即上机检测 打开流式细胞仪
14、：预热及进行质控程序 选择相应的方案或新建方案 加载或重新调节各参数 上样检测,技巧一：定位目标细胞群体,寻找细胞群：如标本为外周血，在FS/SS散点图中信号最强的为粒细胞，依次为单核、淋巴、红细胞碎片。要寻找淋巴细胞，可首先调低FS/SS电压定位粒细胞后逐步调高电压依次寻找各细胞群。 使用目标群所特有的表面标志物结合SS信号，可最快、最特异性地定位目标细胞群 如标本中无明显特征细胞群，可使用已建淋巴细胞检测方案根据相对位置定位目标细胞群,技巧二：阴性对照,阴性对照作用：调节PMT电压；设立阴、阳性界线 使用抗体相应同型荧光免疫球蛋白作为阴性对照，注对照及抗体需出自同一厂家（检测一过性样本中的
15、某些指标） 使用对照组样本作阴性对照（与其他实验中对照组含意相同，但此时仍需使阴性对照初始化仪器） 对与非抗体染色，如各类核酸染料或探针：PI、ANNEXIN-V。使用空白标本作为阴性对照，或设立阳性对照。,技巧三：常见故障及解决,时刻注意鞘液及废液桶液量，熟悉仪器各类报警信号 通过软件操作仪器，很少能引起仪器硬件固障 如样本中有可见颗粒，建议过滤后再检测 如仪器经常不使用，管道会结晶、长菌、堵塞、漏气，此时叫工程师便可解决 如仪器出现硬件故障，通常是仪器自身问题，与操作者无关,技巧四：检测指标,检测前要清楚地知道：除阳性百分比指标外，还有荧光强度指标。后者往往比前者更有意义 检测时，灵活应用
16、放大模式：线性或对数（如指标相差不大，使用线性放大，如：SS、FS；一般荧光参数使用对数放大） 灵活运用门的逻辑关系及颜色示踪功能，可使检测结果更为明了 合理选择不同的荧光素标记试剂，以最少的投入获取最多的信息,荧光补偿：极其重要的操作,FITC与PE,调与未调补偿,FL1,FL2,补偿调节原理,补偿调节原理,双色荧光补偿调节标准方法：第一步,IgGFITC/IgGPE 通过调节电压使阴性群体落在FTIC 及PE 双阴性区注在 进行调补偿时必须将原补偿全部归零,双色荧光补偿调节标准方法：第二步,FITC 标记抗体/IgGPE,双色荧光补偿调节标准方法：第三步,通过补偿设置按钮增、减补偿百分数,因为：,所以：,注意！,用来调节补偿的FITC、PE抗体必须有明显的阳性信号，否则就不会出现荧光渗漏现像，调节补偿也无从入手。 在正式数据采集前要调整好补偿，一旦数据被获取，BD、Coulter仪器无法再改变补偿 partec流式细胞仪提供软件调节补偿技术，无论
