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1、原位分子杂交组织化学,In Situ Hybridization Histochemistry (ISHH),一、概念,用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，然后再用与标记物对应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在核酸原有位置进行细胞内定位。,二、原位杂交的基本原理,三、原位杂交组织化学技术的应用,1.细胞特异性mRNA转录的定位； 2.癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平的表达 及其变化的研究； 3.病原微生物检测； 4. 基因在染色体上的定位； 5. 检测染色体的变化； 6. 分裂间期细胞遗传学的研究。,四、核酸
2、探针的种类,根据探针的核酸性质不同 DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针、寡核苷酸探针 根据探针的标记方法不同 放射性探针：32P、3H、35S 非放射性探针：生物素标记 地高辛标记 荧光标记,DNA探针 1. 克隆在质粒载体中，可以无限增殖，制备简便。 2. 不易降解。 标记的方法较成熟多样（切口平移等） cDNA 探针 1. 互补于 mRNA 的DNA 分子。 2. 逆转录合成，不含内含子序列，适宜基因表达的检测。单链比双链灵敏度高，且不需变性，使能与靶mRNA结合的探针浓度提高。,cRNA探针 单链分子，杂交反应效率高。 可控制转录方向，得到同义RNA 探针（与mRNA同序
3、列），或反义RNA 探针（cRNA，与mRNA 互补）。 可检测DNA 和mRNA，还可观察基因的转录状况。 易于降解，标记方法复杂。 寡核苷酸探针 链短、分子量小、序列复杂度低，杂交时间比克隆探针短。 可识别靶序列中一个碱基的变化，故成套探针用于碱基点突变的检测。 一次可大量合成，价格低廉，易于标记。 缺点：与克隆探针比较，特异性差，杂交信号弱。,设计筛选寡核苷酸探针的原则 长30-50bp，长探针则杂交时间长，短则特异性差。 碱基成分：GC含量为 40%-60%。 探针分子内不能有互补区。,五.探针标记,探针的标记物分为放射性标记和非放射性标记两大类： 放射性标记物一般为125I 、35S
4、或32P； 非放射性标记有生物素或地高辛的间接标记，也有FITC或者罗丹明对探针分子的直接标记。,探针标记方法比较 敏感性：放射性探针地高辛探针生物素探针 对人危害性：放射性探针、生物素探针 放射性探针受半衰期限制，不可长期保存。 生物素探针受内源性生物素影响，可致假阳性；地高辛探针则显色复杂。,探针标记方法,探针标记方法很多，大致分为： 引入法和化学修饰法。 *引入法：运用标记好的核苷酸来合成探针； *化学修饰法：采用化学方法将标记物掺入已合成的探针分子中去，或改变探针原有的结构，使之产生特定的化学基团。,引入法较化学修饰法更常用，按其整合的方法不同，引入法分为： *缺口平移法 *随机引物法
5、 *末端标记法 *PCR扩增标记法 *RNA体外转录法,缺口平移法,原理：利用DNA酶I在双链DNA的各股单链的不同位 置上造成随机切口，再利用大肠杆菌DNA聚合酶进 行53修复，将已标记dNTP 掺入到新合成的DNA 链中。,随机引物法,原理：将长6个核苷酸的寡核苷酸片段（随机引物）与 单链DNA或变性的双链DNA随机互补结合（退火），在 引物的3羟基末端逐个加上核苷酸直至下一个引物， 即形成标记的DNA探针。,末端标记法,原理：将标记物导入线性DNA或RNA的5端或3端的一类 标记方法。主要分为： 5末端标记法，3末端标记 法，T4聚合酶替代法。,五、ISHH基本程序（以检测组织细胞内的m
6、RNA为例）,(一）杂交前处理 玻片预处理（灭活Rnase) 切片处理（增强组织通透性和探针穿透性）,1.玻片预处理（灭活Rnase) 玻片置于热肥皂水浸泡4小时以上 自来水 清洗干净置于酸缸中浸泡过夜 清水洗净烘 干 烘箱温度最好在150或以上烤干4小时 以上。以去除任何RNA酶.盖玻片在有条件时 最好用硅化处理,锡箔纸包裹无尘存放. 粘附剂:常用的粘附剂多聚赖氨酸溶液。,2 .切片处理：增强组织通透性和探针穿透性 1）充分脱蜡 2）防止探针与组织中碱性蛋白静电结合，降低背景 稀酸处理（0.2 mol/l HCL 10min） 乙酰化（0.25%乙酸酐10min）,3）去污剂：增加组织通透性
7、，利于探针进入 0.01%-0.3% Triton X-100 15min 4）酶消化：使经固定后被遮蔽的靶核酸暴露 蛋白酶K、链酶蛋白酶、胃蛋白酶 1ug/ml蛋白酶K ，37，15-30min 5）杂交缓冲液孵育：阻断非特异性结合位点,3.防止RNA酶的污染 由于在手指皮肤及实验用玻璃皿上均可能有RNA酶,为 防止其污染影响实验结果,在整个杂交前处理过程都需戴 消毒手套.所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日 置高温(160)烘烤以达到消除RNA酶的目的.要破坏RNA 酶,其最低温度必需在150左右.,（二） 杂交反应： 将杂交液滴于经预杂交处理的组织细胞切片上，加盖硅化的盖玻片，按所要
8、求的温度进行的孵化。,杂交液 1）一定浓度的探针 2）高浓度Na+:使杂交率增加，减少静电结合 3）硫酸葡聚糖：10%硫酸葡聚糖，形成探针混合液基质， 对DNA有浓缩作用，可提高杂交的反应速度10倍以上， 但不影响探针的洗脱强度；杂交时常用浓度为5% 10%，但浓度高时会使溶液的粘度增大，不利杂交探 针的渗透。 4）牛血清白蛋白、载体DNA或RNA：阻断非特异 性结合，降低背景。,探针浓度： 以最低浓度达到与靶核酸的最大饱和结合度 0.5-5.0ug/ml，10-20ul/片 杂交时间： 一般为1620小时 杂交严格度： 反应体系中避免非同源性或只有部分同源性的核酸顺序形成杂交复合物的条件。
9、低杂交温度、低甲酰胺的浓度、高离子强度条件下，严格度低，反之严格度高。严格度愈高，杂交反应特异性愈强，但敏感性愈低。,(三）杂交后处理 目的：除去未参与杂交体形成的过余探针，除去探针与组织标本之间的非特异性结合，降低背景，有利于信号的检测。 盐溶液洗涤：盐浓度 由高至低 温度 由低至高 高浓度的盐可减少探针与组织标本间的静电结合。 洗涤过程中至少有一次高严格度条件下的洗涤，即 低盐、高温、高甲酰胺,(四）杂交显示 放射自显影 酶检测系统（HRP、AP）,(五）对照实验和结果判断 组织对照、探针对照、杂交反应对照、检测系统对照 例：将切片应用RNA酶或DNA酶进行预处理后杂交 应用同义RNA探针进行杂交 以不加核酸探针的杂交液进行杂交 组织对照采用已知阴性或阳性组织 用未标记的探针进行杂交 以上方法任选3-4种，综合判断。,the end Thank you！,
