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1、苏州大学 博士学位论文 依达拉奉对重症急性胰腺炎大鼠脑损伤保护作用的实验研究 姓名：王小红 申请学位级别：博士 专业：内科学（消化系病） 指导教师：沈云志 20100301 依达拉奉对重症急性胰腺炎大鼠脑损伤保护作用的实验研究中文摘要 依达拉奉对重症急性胰腺炎大鼠脑损伤保护作用的 实验研究 中文摘要 第一部分重症急性胰腺炎并发脑损伤的动物模型制作 目的建立易复制、重复性好的重症急性胰腺炎( S A P ) 并发脑损伤动物模型，为 实验的第二部分和第三部分提供实验动物。方法6 0 只雄性S D 大鼠随机分为六组： 正常对照组3 h 、6 h 、1 2 h 组及S A P 组术后3 h 、6 h
2、、1 2 h 组，每组各1 0 只。以0 1 m l m i n 匀速逆行胰管注入5 牛磺胆酸钠( 0 1 m l l O O g ) 建立S A P 并发脑损伤大鼠模型。牛磺 胆酸钠注射后3 h 、6 h 、1 2 h 检测大鼠血浆淀粉酶、脑组织含水量、脑组织微血管内聚 集和附壁的白细胞计数以及胰腺和脑组织镜下病理学改变。结果血浆淀粉酶、胰腺 组织镜下病理学评分及脑组织微血管内白细胞聚集及附壁计数各时间点水平均比正 常对照组显著升高( P 、 ，：； t 一、。、。- _ j + r 。一 I j 。、 o ：? 二、F 4 1 b 。：o 枣 瓯- - - 、：，- r 、霞， 二毒。一，
3、i -“7 。 。，+ 气。、。，一 ，“ 亭。I I - -1 ， - r - ! 1 、 图3 9 依达拉奉干预1 2 h 组脑组织的病理改变( H E x 2 0 0 ) 图4 0 阳性对照1 2 h 组脑白质的病理改变( 电镜1 5 0 0 0 ) 4 2 依达拉奉对重症急性胰腺炎大鼠腑损伤保护作用的实验研究 第二部分 警_ 瓷璃 一 图4 1 依达拉奉干预1 2 h 组脑白质的病理改变( 电镜X1 5 0 0 0 ) 图4 2阳性对照1 2 h 组脑皮质的病理改变( 电镜1 5 0 0 0 ) 图4 3 依达拉奉干预1 2 h 组脑皮质的病理改变( 电镜1 5 0 0 0 ) 4 3
4、 第一三部分依达拉卒x , I 五瓤急忡胰腺炎人 l ：【胍损伤保护作川的实验研究 表3 - 23 组大鼠各时点血浆T N F - a 水平比较( _ ts ) 注a ：处理组及I j J 陛对照纽j 0 S A P 组相应各时点比较。P O 0 5 ；注b ：S A P 组术 后1 2 hL j S A P 宝H 术后3 h ：E 较，。P O 0 5 图4 43 组人鼠各H 寸点血浆T N F - a L E 较柱形图 3 血浆T N F a 水平变化 S A P 组1 2 h 水平明显高于3 h ( P O 0 5 ) ；处理组及阳性埘照组1 2 h 较S A P 组1 2 h 水平明显
5、降低( P 0 0 5 ) ( 见表 3 2 及图4 4 ) 。 4 脑组织微血管内白细胞聚集及附壁计数 S A P 组随着时问的延K ，其水平逐渐升高，S A P 组1 2 h 明显高于3 h ( P 0 0 5 ) ( 见表3 3 及图4 5 ) 。 依达拉奉时t 症急十牛胰腺炎大 | ；i M 损伤保护作J | J 的实验研究 第部分 表3 - 3 ：3 组大鼠各日, j - 点腑组织微血管内白细胞聚集及附擘计数比较( _ ! s ) 注a ：处理组及刚性对照纲与S A P 多H 相应各时点比较P O 0 5 ；注b ：S A P R 术后1 2 h 与S A P 组术后3 h i ：P
6、 , 较，P O 0 5 ，一P O 0 1 图4 53 组大鼠各时点比较柱形图 5 脑组织Y I ) A 、T N F a 水平变化 S A P 组1 2 h 明显高于3 h ( P O 0 5 ) ；处理组及阳性对照组1 2 h 较S A P 组1 2 h 水甲明 显降低( P 0 0 5 ) ( 见表f 3 _ 4 及 图1 6 、1 7 ) 。 4 5 第二部分依达拉车时亚症急件胰腺炎大鼠胁i 损伤保护作川的实验研究 表3 - 43 组大鼠各时t i 脑组织M D A 、T N f ? 一a 水平比较( 一X t s ) 注a ：处理组及附生对照纪与S A P 纽相应各时点比较。P O
7、 0 5 ：注b ：S A P 组术后1 2 h 与S A P 组 术后3 h 比较，P O 0 5 图4 63 组大鼠各时点脑组织M D A 水平比较柱形图 r 。1 1 。 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _处理绀 - 性对 照组 图4 73 组大鼠各时点腩组织T N F a 水平比较柱形图 依达拉奉埘西疵急性胰腺炎大鼠胁i 损伤保护作的实验研究第三卸分 6 脑组织N F K Bp 6 5m R N A 水平变化 ( 1 ) 脑组织总R N A 完整性及纯度测定 取1 u 1 总R N A 样品在1 5 琼脂糖甲醛变性凝胶f ：电泳，可见二条清晰的条带， 分别为2 8 SR N
8、 A 、1 _ j SR N A 及5 8 SR N A ，无拖尾现象，表明抽提的总R N A 是完整的。 纯度测定将总R N A 样品作2 0 0 倍稀释，以三蒸水作空白对照，读耿紫外分光光度计在 波长2 6 0 n m 与2 8 0 n m 处的0 D 值，A 2 6 0 A 2 8 0 在1 8 2 0 之问，表明R N A 纯度较高， 无蛋白质等污染。 表3 - 53 组大鼠各时点腑组织N F - K1 3p 6 5m R N A 表达比较( _ ts ) 注a ：处理组及附陛对照组1 j S A P 组相应各时点比较7P O 0 5 ；滓b ：S A P 2 H 术后1 2 h j
9、S A P 坌N 术后3 h L L 较，P O 0 5 图4 83 组大鼠各时点脑组织N F KBp 6 5m R N A 平H j a c ti n L L 值比较杜彤幽 4 7 第二部分依达拉奉刈重疵急性胰腺炎人鼠J J l i i 损伤保护作J I J 的实验研究 ( 2 ) 脑组织N F K Bp 6 5m R N A 表达 S A P 组1 2 h 明显高于3 h ( P 0 0 5 ) ；处理组及阳性对照组1 2 h 较S A P 组1 2 h 水平明 湿降低( P 0 0 5 ) ( 见表3 5 及 图4 8 5 0 ) 。 123456 M p a c t i n ( 4 5
10、 3 b p ) 注a ：L a n eM ：M a r k e r ；注b ：L a n e l 、2 分别为S A P 组3 h 、1 2 h ：注c ：L a n e 3 、 4 分别为处理 H 3 h 、1 2 h ；注d ：L a n e 5 、6 3 9 别为口兀性对照组3 h 、1 2 h 图4 9 B a c tin 内参基因P E R 电泳图 N F k BP 6 5 ( 1 8 6 b p ) - 12 345 6M 注a ：L a n eM ：M a r k e r ；注b ：L a n e l 、2 分别为S A P 组3 h 、1 2 h ：注c ：L a n e 3
11、 、 4 3 别为处理组3 h 、1 2 h ；注d ：L a n e 5 、6 5 别为附| 生对照组3 h 、1 2 h 图5 0 N F KBp 6 5m R N A 目的基I * 1P C R 电泳图 4 8 依达拉奉对重症急性胰腺炎大鼠脑损伤保护作用的实验研究第三部分 讨论 本研究通过建立S A P 大鼠模型，观察依达拉奉对大鼠S A P 并发脑损伤的保护作用。 研究结果显示，S A P 组术后各时点的血浆淀粉酶水平及胰腺组织镜下病理学评分均比 正常对照组明显升高( P ( O 0 5 “ - 0 0 1 ) ，说明S A P 建模成功。进一步的研究结果显示， S A P 组6 h
12、、1 2 h 脑组织含水量、脑组织镜下病理学评分及各时点脑组织微血管内白细胞 聚集及附壁计数、脑组织M D A 、脑组织T N F a 、脑组织N F KBp 6 5m R N A 与正常对照组 比较差异均有统计学意义( P O 0 5 - - - - 0 0 1 ) ，提示大鼠S A P 并发脑损伤建模成功。 依达拉奉是由日本新开发的一种自由基清除剂，具有“自由基清道夫“ 之称，目 前广泛应用于人体缺血再灌注损伤，尤其是缺血性脑损伤。依达拉奉化学名为3 一甲基 一卜苯基一2 一吡唑啉- 5 - 酮，其分子量为1 7 4 2 0 ，含亲脂性基团，血脑屏障的通透率为 6 0 ，可抑制黄嘌呤氧化酶
13、和次黄嘌呤氧化酶的活性，降低羟自由基浓度，抑制氢氧根 离子和铁离子介导的脂质过氧化作用，从而抑制脑细胞、血管内皮细胞和神经细胞的 氧化损伤，并抑制迟发性神经元死亡L 2 J 。依达拉奉还能通过刺激P G l 2 生成，减少炎症 介质白三烯生成，而抑制炎症反应的发生发展。宋德静【3 l 等研究发现，依达拉奉对大 鼠肝脏缺血再灌注损伤有保护作用，其机制可能通过清除氧自由基，抑制脂质过氧化 和抑制N F KB 的活化来实现。近期有研究发现，在多种炎性疾病中，依达拉奉可降低 自由基诱导的致炎细胞因子的生成，从而有效抑制了炎症反应，促进了器官功能的恢 复。其可下调T N F a 、I L - 8 、I
14、L - 6 、C R P ，使抑炎因子I L - 1 3 升高，依达拉奉可能通过 阻断炎症级联反应，抑制炎性因子的生成而起到脑保护作用【4 5 】。Y a n g 等【6 l 用T N F - a 拮抗剂治疗大鼠S A P ，使血中T N F - a 浓度下降，胰腺组织损害减轻，并对S A P 介导的脑 组织损害起间接保护作用。宋磊等【7 】研究认为，糖皮质激素可通过抑制炎症反应，改 善微循环，清除自由基等作用对A P 相关性脑损伤有预防和治疗作用。王峻【8 l 研究发现 甲基强的松龙可以降 氐S A P 模型早期脑组织基质金属蛋白酶一9 表达，减轻脑水肿，改 善脑内炎症反应，减轻血脑屏障的破
15、坏，降低血清基质金属蛋白酶一9 、I L 一6 等水平， 减轻大鼠S A P 脑损伤的严重程度，对S A P 相关性脑损伤具有保护作用，因而本研究以甲 基强的松龙作为阳性对照组。本研究结果显示，应用依达拉奉不但使S A P 大鼠血浆淀 粉酶水平下降、使胰腺组织病理损伤减轻、使脑组织微血管内白细胞聚集及附壁计数 下降、脑组织含水量降低、脑组织病理损伤减轻，而且使S A P 大鼠脑组织自由基代谢 4 9 第三部分依达拉奉对重症急性胰腺炎大鼠脑损伤保护作用的实验研究 产物M D A 显著降低，明显抑带t J S A P 大鼠脑组织N F KB 的激活，使血浆及脑组织T N F - a 表 达显著降低
16、，且与阳性对照组相比，各时点各项指标均无统计学差异。由此说明，依 达拉奉可能通过清除S A P 大鼠脑自由基，抑角J J N F - KB 的激活，减少T N F a 等细胞因子 的产生，抑制炎症反应，从而对S A P 大鼠脑损伤起保护作用。需要进一步说明的是： 本实验使用甲基强的松龙作为阳性对照组，其作用肯定，但其副反应明显大于依达拉 奉，主要有：诱发和加重感染，物质代谢和水盐代谢紊乱，可诱发和加剧消化 性溃疡等。临床安全性依达拉奉明显优于甲基强的松龙。 综上所述，S A P 早期应用依达拉奉可抑制炎症介质释放，从而阻断其发病环节， 对防治S A P 相关性脑损伤起积极作用，值得进一步临床应用。 参考
