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1、中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名：量垒垄日期： 卅o 、9 3 - 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在 攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中
2、国医科大学。本人保证毕业离 校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师 为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学 校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩 印或其他手段保存论文。 论文作者签名： 指导教师签名： 泾红俸 一 日 期：型竺：尘! 丝 一、摘要 结论1 3 四、本研究创新性的自我评价1 4 五、参考文献15 六、附录 综述1 7 在学期间科研成绩2 9 致 射3 0 个人简介31 中文论著摘要 依西美坦联合多烯紫衫醇对人子宫内膜癌裸鼠移植 瘤
3、抑制作用的实验研究 目的 探讨第三代芳香化酶抑制剂依西美坦和多烯紫衫醇单独和联合用药对人子宫 内膜癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用及其相应机制。 方法 将处于对数生长期的人子宫内膜腺癌I s h i k a w a 细胞接种于裸鼠皮下，建立裸 鼠的移植瘤动物模型，将荷瘤裸鼠随机分为4 组，每组5 只，依西美坦和多烯紫 衫醇分别单独和联合处理裸鼠移植瘤模型3 周，对照组予以生理盐水3 周，计算 各组移植瘤体积、抑瘤率及裸鼠体重，肿瘤组织标本进行H E 染色病理检查，并 用T U N E L ( 脱氧核苷酸转移酶介导的d U T P 缺I ：1 末端标记) 法检测细胞凋亡情况。 结果 依西美坦组、多烯紫
4、衫醇组的抑瘤率分别为2 5 5 9 和2 7 4 1 ，联合用药组的 抑瘤率则为4 7 0 9 ，联合用药组与单独用药组及对照组比较差异均有显著性 ( P O 0 5 ) ，见表l 。 表1 ，各组裸鼠用药前后体重的变化( g ，x 虹) 三、抑瘤效果观察 对照组移植瘤体积进行性增大明显，而依西美坦组和多烯紫衫醇组移植瘤体 积增大稍缓慢，联合用药组增大尤其缓慢，与对照组相比，各用药组移植瘤体积 差异有统计学意义( P O 0 5 ) ，而联合用药组与单独用药组及对照组比较差异均有 显著性( P O 0 5 ) ；从抑瘤率来看，用药组的抑瘤率均明显低于对照组( P O 0 5 ) ，而 8 且联
5、合用药组具有更高的抑瘤率，与其他3 组相比差异均有统计学意义( 尸 O 0 5 ) 。 见图1 ，2 和表2 。 AB CD ( A 为对照组；B 为依两美坦组；C 为多烯紫衫醇组；D 为联合用药组) 图1 ，依西美坦、多烯紫衫醇对裸鼠移植瘤生长的抑制作用比较 图2 ，各组裸鼠皮下移植瘤生长曲线 表2 ，依西美坦、多烯紫衫醇对裸鼠移植瘤生长的抑制作用比较( x 蜘) 9 四、移植瘤病理改变 移植瘤呈实性，圆形或椭圆形，对照组部分瘤体呈不规则的椭圆形，与周围组 织界限清楚，容易剥离。肿瘤组织呈灰白色，质硬，较脆。大体尸检未见有腹水 或其它器官的转移。H E 染色后光镜下观察：对照组可见境界清楚的
6、癌巢，肿瘤细 胞呈条状、索状，可见瘤巨细胞，细胞核异型明显，如图3 ；与对照组相比，用药 组肿瘤细胞略增大，部分细胞固缩，裂解，可见凋亡、坏死细胞。肿瘤组织内有 较多的坏死组织和炎性细胞浸润，有明显的纤维化形成，显示出肿瘤细胞的生长 受至0 抑锖0 ，如图4 6 。 五、T U N E L 法检测裸鼠肿瘤组织细胞凋亡情况 各用药组与对照组相比，其细胞凋亡率差异有统计学意义( P O 0 5 ) ；其中依 西美坦和多烯紫衫醇联合用药组具有更高的细胞凋亡率，与对照组、单独用药组 相比差异均有统计学意义俨 0 0 5 ) ，结果见表3 和图7 1 0 。 表3 ，依西美坦、多烯紫衫醇对肿瘤组织细胞凋
7、亡的影响( x 姆) 组别凋亡指数( 舢) 对照组 依西美坦组 多烯紫衫醇组 联合用药组 1 3 5 2 士1 4 2 3 0 9 2 士2 9 5 3 2 6 5 士2 7 2 4 0 1 4 + 3 4 4 图3 ，对照组移植瘤病理改变 ( H E 2 5 0 ) 1 0 图4 ，依西美坦组移植瘤病理改变 ( H E x 2 5 0 ) 图5 ，多烯紫衫醇组移植瘤病理改变 图6 ，联合用药组移植 ( H E 2 5 0 ) ( H E 2 5 0 ) 图7 ，对照组移植瘤细胞凋亡 ( 2 5 0 ) 瘤病理改变 图8 ，依西美坦组移植瘤细胞凋亡 ( 2 5 0 x ) 图9 ，多烯紫衫醇组
8、移植瘤细胞凋亡 图1 0 ，联合用药组 (250x)(250x) 1 1 移植瘤细胞凋亡 讨论 子宫内膜癌是女性生殖道常见三大恶性肿瘤之一，通常认为其发生、发展与 长期外源性或内源性无抵抗的雌激素刺激和无孕激素抵抗有关，因此近年来抗雌 激素治疗越来越受到大家的关注和认可。据研究表明由于某些原因机体内或子宫 内膜癌组织中芳香化酶表达增加，局部雌激素浓度升高，刺激肿瘤细胞增殖，且 雌激素水平与临床分期和肿瘤浸润正相判引。 芳香化酶抑制剂为激素治疗提供了新的选择，依西美坦为一种不可逆性甾体 类芳香化酶灭活剂，结构上与该酶的自然底物雄烯二酮和睾酮相似，可作为假底 物竞争占领酶的活性位点，并以其共价键形
9、式不可逆结合，形成中间产物而引起 永久性的酶灭活，从而抑制雌激素的合成【_ 7 8 1 ，可显著降低芳香化酶及血液雌激素 水平，同时不会产生明显的雄性性征效应，不良反应较i X 9 1 。临床研究已证实依 西美坦等芳香化酶抑制剂对乳腺癌的治疗作用优于他莫昔芬【I o 】。目前依西美坦已 成功用于治疗乳腺癌、子宫内膜异位症等雌激素依赖性肿瘤【1 1 】。但对子宫内膜癌 的研究较少，目前已有一些临床试验性的研究，B c r s t e i n 等【1 2 】以新辅助化疗的方式 用依西美坦治疗I 期子宫内膜癌患者，发现能改善患者的某些临床症状如腹痛缓 解、子宫出血减少、肿瘤缩小、血E 2 浓度、芳香
10、酶活性均有不同程度的下降，尚 未有动物实验及系统的体外实验研究文献。 芳香化酶在人和鼠中均只由一个C Y l 9 基因编码，针对该基因的干扰或对其产 物的抑制剂能有效地减少雌激素的生物合成【1 3 】。本研究首先建立人子宫内膜癌裸 鼠移植瘤模型，通过依西美坦干扰芳香化酶的表达初步探讨了依西美坦的体内抗 肿瘤作用，比较用药前后裸鼠移植瘤体积、抑瘤率、细胞凋亡率等，发现对照组 肿瘤体积增长明显，依西美坦组移植瘤体积增长相对缓慢，细胞凋亡率明显增高， 肿瘤细胞胞浆形态亦发生明显变化，大部分处于变性、裂解状态，相比有显著性 差异，说明依西美坦在体内有抗肿瘤的作用。关于依西美坦的抗肿瘤作用机制， 一方面
11、可能是通过阻断裸鼠体内雌激素的合成来抑制子宫内膜癌的生长；另一方 面，依西美坦也有可能通过其他直接促进细胞凋亡的途径而发挥作用：0 ) S a s a n o 掣1 4 】进行的体外研究发现芳香化酶抑制剂能降低组织培养的内膜癌细胞的融6 7 ， 即能降低癌细胞的增殖能力；S u r v i v i n 是一个新发现的凋亡抑制剂( 队P ) 家族成 1 2 员，其广泛表达于人的胚胎组织和各种肿瘤组织，具有抑制细胞凋亡和调节细胞 有丝分裂的双重功能【1 5 】。有研究【1 6 1 表明，依西美坦作用子宫内膜癌细胞后，S u r v i v i n 蛋白和S u r v i v i nm R N A
12、 表达明显下调，提示依西美坦可能通过抑制雌激素的合成， 从而下调S u r v i v i n 表达，进一步影响子宫内膜癌细胞的生长。 化疗是目前治疗子宫内膜癌的主要手段之一，但其非特异性的毒副作用和耐 药性增加了临床治疗难度。化疗药物与依西美坦的协同作用可以大大增强对肿瘤 细胞的杀伤作用。国外研究表明，亚毒性剂量的多烯紫杉醇联合依西美坦对人乳 腺癌细胞的杀伤效率明显增强1 7 】。这一实验结果也在本实验中得到了验证。我们 研究发现，依西美坦与多烯紫杉醇有明显的协同作用。从抑瘤率来看，用药组的 抑瘤率均明显低于对照组俨 O 0 5 ) ，而联合用药组具有更高的抑瘤率，与其他3 组 相比差异均有
13、统计学意义( P 0 0 5 ) 。T U N E L 法检测结果显示，依西美坦处理组可 见细胞发生凋亡，而当依西美坦与多烯紫杉醇联合应用时，其凋亡率明显升高， 显著高于两药单独处理。这与M o n d e s i r e 等【1 7 】对人乳腺癌细胞所进行的研究结果相 似。提示依西美坦联合多烯紫杉醇较两药单独处理对人子宫内膜腺癌I s h i k a w a 细胞 裸鼠移植瘤的抑制作用更为明显，能够更好地发挥二者的协同作用，起到抑制增 殖，诱导凋亡的作用。这为依西美坦在子宫内膜癌的临床应用开辟了新的途径。 本研究结果证实，通过依西美坦和多烯紫衫醇联合用药显著增强了对子宫内 膜癌裸鼠移植瘤的生
14、长抑制，达到了抑制肿瘤细胞增殖和诱导其发生凋亡的作用， 为临床上化疗结合内分泌疗法治疗子宫内膜癌等雌激素依赖性肿瘤提供了非常有 益的思路及实验基础。 结论 1 依西美坦和多烯紫衫醇均可抑制人子宫内膜癌裸鼠移植瘤的生长。 2 依西美坦和多烯紫衫醇联合用药较两药单独应用对人子宫内膜癌裸鼠移 植瘤的抑制作用更为明显，具有协同作用。 1 3 本研究创新 首次将依西 药联合应用对人子宫内膜癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用及其相应机制，为临床化 疗结合内分泌疗法治疗子宫内膜癌等雌激素依赖性肿瘤提供了实验基础和理论依 据。 1 4 参考文献 1L a n eD P Ad e a t hi nl i f eo f
15、P 5 3 N a t u r e ，1 9 9 3 ，3 6 2 ；7 8 6 - 7 8 8 2 L e g r oR S ，K u n s e l m a nA R ，M i l e rS A ，e ta LR o l eo fa n d r o g e n si nt h eg r o w t ho fe n d o m e t r i a l c a r c i n o m a ：a ni nv i v oa n i m a lm o d e l A mJ0 b s t e tG y n e c o l ，2 0 0 1 ，1 8 4 ( 3 ) ：3 0 3 3 0 8 3 J o n g e nV H ，H o l l e m aH ，V a nD e rZ e eA G ，e ta 1 A r o m a t a s ei nt h ec o n t e x to fb r e a s ta n d e n d o m e t r i a lc a n c e r M i n e r v aE n d o c r i n o l ，2 0 0 6 ，31 ( 1 ) ：4 7 6 0 4P r o n kL C ，S t o
