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1、究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名：立夏笺! 叁 日期： 呈：。厶：三 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在 攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离 校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且
2、导师 为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学 校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩 印或其他手段保存论文。 论文作者签名：立二蚕苎塾 指导教师签名： 日 期： 前言3 1日舌3 l 材料与方法3 2 实验结果4 1 讨论4 8 结论4 9 论文三、氯化锂处理对脾切除大鼠空间学习记忆能力的影响 苜订言5 0日I J 舌b U 材料与方法5 1 实验结果5 6 讨论6 3 结论6 4 四、本研究创新性的自我评价6 5 五、参考文献6 6 六、附录 综j 苤7 4 在学期间科
3、研成绩8 3 8 4 8 5 中文论著摘要 低温、手术创伤对大鼠空间学习记忆能力的影响 刖吾 T a u 蛋白是一种具有生理功能的可溶性蛋白，能够与微管蛋白结合，在神经 元及轴突的生长过程中起着重要作用。二十世纪8 0 年代最早有报道描述了t a u 蛋 白，后来不断发现t a u 蛋白还有高度磷酸化和神经纤维缠结( n e u r o f i b r i l l a r yt a n g l e s ( Y F T s ) ) 的形式存在。在以后2 0 年里，N F T 被认为是神经退行性变的病理基础。 但是，许多研究中发现，N F T 形成之前的高度磷酸化t a u 蛋白的聚集同样导致记
4、忆紊乱，利用转基因鼠的研究也提示，其空间记忆的损害与t a u 病理有关。全身 麻醉药能够明显地损害正常的体温调节，导致围手术期低温。有关围手术期低温 引起的生化改变，以及对t a u 病理和学习记忆的影响却知之甚少。已有研究报道 了麻醉对鼠脑t a u 蛋白磷酸化的影响，发现并非麻醉本身，而是继发于麻醉的低 温抑制了磷酸酶活性，从而导致t a u 蛋白磷酸化。 近些年，术后认知功能障碍逐渐成为研究热点，但是，对于体内有关炎性反 应影响t a u 病理，从而引发学习记忆改变的研究并不多见。关于炎性因子对啮齿 类认知功能的影响的研究提示，对于老年鼠，小手术即可以引发夸大的神经炎性 反应，但并不损
5、害其M o r r i s 水迷宫的测试能力，另一研究提示，手术引发了大鼠 短暂的认知下降，并且伴随有短暂的海马内胶质细胞的激活和促炎性因子的释放。 糖原合酶一3 3 ( g l y c o g e ns y n t h a S ek i n a s e 一3 b e t a ，G S K - 3 1 $ ) 是A D 大脑中神经纤维 缠结形成之前的一个重要的磷酸化t a u 蛋白的激酶。G S K - 3 1 B 能够促进小胶质细胞 对炎症的反应，而利用其抑制剂可以局限这种反应。在人类包涵体肌炎的细胞中， 利用氯化锂抑制G S K 3 p 的活性可以减轻t a u 蛋白的磷酸化，G S K
6、3 B 和t a u 蛋白 的共同定位，进一步说明G S K 3 p 在t a u 病理中的作用。因此，我们探究了手术创 伤引发的免疫反应是否增加神经炎性反应和认知损害，而且，我们更关注于炎性 因子是否通过G S K - 3 1 3 介导t a u 病理。 虽然低温可能对危重病人有利，但是围手术期由麻醉带来的低温对大多数病 人是有害的。低温虽然没有引起明显的神经损害，但是可能带来认知功能障碍。 本研究旨在利用Y - 迷宫对大鼠工作记忆和参考记忆进行测试，探讨暴露于临床相 关浓度的异氟烷是否导致t a u 蛋白高度磷酸化以及是否带来记忆损害。同时，我 们测试了给与或不给予氯化锂处理的脾切除鼠的空
7、间记忆能力，试图揭示围手术 期低温以及炎性因子对术后认知功能的影响机制。 材料和方法 雄性成年S D 大鼠购于中国医科大学动物实验中心，6 月龄，体重3 5 0 4 0 0 9 ，动 物在2 2 2 3 0 C 环境中自由活动，1 2 ：1 2 小时R 夜循环，自由进食水。大鼠吸入异氟烷 麻醉诱导后气管插管，机械通气维持异氟烷浓度为1 3 1 5 ，期间监测大鼠心 电图及直肠温。 实验一：大鼠随机分为三组：健康对照组( g r o u p A ；n = 1 5 ) 无任何干预措施。 麻醉保温组( g r o u pB ；n = 6 0 ) ，大鼠异氟烷麻醉后利用加温挚保持体温在3 6 0 -
8、3 7 0 。C 。麻醉低温组( g r o u pC ；n = 6 0 ) ，大鼠麻醉后暴露于2 2 。C 室温。麻醉后大鼠 自然苏醒分笼饲养。B ，C 组大鼠分别于2 h 麻醉后即刻，麻醉后l ，3 ，7 天( 1 5 只时点) 处死，标记为B 0 ，B 1 ，B 3 ，B 7 ，C O ，C 1 ，C 3 ，和C 7 。 实验二：大鼠随机分为三组：健康对照组( g r o u p A ；n = 1 5 ) 无任何干预措施。 手术保温组( g r o u pB ；n = 4 5 ) ，大鼠异氟烷麻醉后利用加温垫保持体温在3 6 0 - 3 7 0 。C ，行脾切除。手术低温组( g r o
9、 u pC ；n = 4 5 ) ，大鼠麻醉后暴露于2 2 。C 室温行 脾切除。B ，C ，组所有动物均麻醉2 小时，B ，C 组手术后l ，3 ，7 天处死( 1 5 只时 点) 。B ，C 组动物每个时点标记为B l ，B 3 ，B 7 ，C 1 ，C 3 和C 7 。 实验三：大鼠随机分为三组：健康对照组( g r o u p A ；n = 1 5 ) 无任何干预措施。 手术和氯化钠组( g r o u pC ；n = 4 5 ) ，异氟烷麻醉后脾切除，腹腔注射氯化钠。手术 和氯化锂组( g r o u pD ；n = 4 5 ) ，异氟烷麻醉后脾切除，腹腔注射氯化锂。B ，C 组所有
10、 动物均麻醉2 小时，期间保持体温3 6 3 7 ，B ，D 组手术后l ，3 ，7 天处死( 1 5 只时点) 。B ，C 组动物每个时点标记为B l ，B 3 ，B 7 ，C l ，C 3 和C 7 。 利用Y - 迷宫电刺激仪测试大鼠空间学习和记忆能力。免疫组织化学方法定位 磷酸化t a u 蛋白，t o t a lt a u 蛋白以及G S K - 3 1 3 表达。蛋白印迹分析方法检测磷酸化 2 t a u 蛋白，t o t a lt a u 蛋白，I L 1p 蛋白，T N F 0 【蛋白以及G S K 3 D 表达变化。利用丝 氨酸苏氨酸磷酸酶测定系统进行蛋白磷酸酶2 A ( P
11、 P 2 A ) 活性测定。实时定量P C R 分析I L 11 3 m R N A 和T N F c t m R N A 变化。 实验数据统计为均数4 - 标准差。利用S P S S l 3 0 软件分析，同组间参数分析利 用t 检验，不同组问参数比较利用单因素或多因素方差分析，后继D u n n e t t 检验， P O 0 5 认为有显著性差异。 结果 实验一：异氟烷麻醉后2 h 诱发低体温，大鼠直肠温度可以最低下降到2 6 0 0 C 。 麻醉期间的低温诱发麻醉后1 天工作记忆的短暂损害。室温下暴露于异氟烷诱发 大鼠脑内t a u 蛋白磷酸化，T l l r 2 0 5 位点和S e
12、 r 3 9 6 位点与对照组比较分别增加了1 0 倍和2 9 倍，但t o t a lt a u 没有显著变化。高度磷酸化T h r - 2 0 5 和t o t a lt a u 抗体双 染表达定位于海马C A l 区。当麻醉鼠进行保温处理时，磷酸化位点恢复到对照组 水平。麻醉诱发的低温抑制大鼠脑内P P 2 A 活性下降4 5 ，保温后活性恢复。 实验二：麻醉后低温接受手术大鼠，术后l ，3 天工作记忆短暂损害。麻醉后 保温接受手术大鼠，术后3 天工作记忆短暂损害。手术后3 天大鼠脑内t a u 蛋白 T h r 2 0 5 位点和S e r 3 9 6 位点磷酸化与对照组比较分别增加了
13、2 7 倍和1 1 倍，但t o t a l t a u 没有显著变化。高度磷酸化T h r - 2 0 5 和G S K 3 D 抗体双染表达定位于海马C A l 区。与对照组比较，术后第1 ，3 天手术保温组I L 1 I B m R N A 分别增加1 6 倍和6 0 ， 手术低温组增加1 7 3 倍和1 6 倍。术后1 天手术保温组和低温组T N F a m R N A 的 表达分别增加O 3 2 和l 倍，第3 天低温组T N F a m R N A 的表达增加0 6 倍。术后 1 天，保温组和低温组I L 1 B 蛋白表达分别增加O 7 3 和1 3 5 倍。T N F a 蛋白表
14、达 没有显著变化。在手术组大鼠，G S K - 3 1 3 激活，表现为无活性状态的磷酸化G S K 3 B 的保温组和低温组分别降低5 5 和5 3 ，而G S K 3 B 总体水平没有变化。 实验三：手术后接受氯化钠处理的大鼠，术后3 天测试工作记忆短暂损害。 手术后接受氯化锂处理的大鼠，术后工作记忆与对照组没有明显差异。手术创伤 使氯化钠组大鼠术后3 天脑内t a u 蛋白T | 屹0 5 位点和S e r 3 9 6 位点磷酸化与对照组 比较分别增加了2 7 倍和1 2 倍，但t o t a lt a u 没有显著变化。给与氯化锂干预后t a u 蛋白与对照组没有明显变化。高度磷酸化T h r - 2 0 5 和G S K 3 D 抗体双染表达定位 于海马C A l 区。与对照组比较，术后第l ，3 天氯化钠组I L 1 p m R N A 分别增加 1 5 和0 5 倍，氯化锂组增加1 4 倍和5 0 ( P 0 0 1 ) 。术后l 天，氯化钠组和氯化锂 组I L 1 B 蛋白表达分别增加0 9 和0 6 7 倍。术后第1 天两组T N F a m R N A 的表达 均增加O 2 3 倍。T N F 0 【蛋白表达没有显著变化。在氯化钠组，G S K - 3 3 激活，表 现为无活性状念的磷酸化G S K 3 p 降低5 5 ，而G
