地衣芽孢杆菌制淀粉酶.

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1、地衣芽孢杆菌制淀粉酶的代谢与调控,-淀粉酶在工业中的应用,地衣芽孢杆菌制-淀粉酶,-淀粉酶产量的影响因素,-淀粉酶的研究进展,目录,-淀粉酶在工业中的应用,淀粉酶的系统命名为1，4 葡聚糖4 葡聚糖水解酶( EC 3.2.1.1) ，是重要的工业酶制剂，可以随机切断直链淀粉或支链淀粉中相邻的1，4 糖苷键、将淀粉水解为糊精和一系列以葡萄糖为组成单位的低聚糖。 淀粉酶最早在1811 年由Kirchhoff 发现，它广泛分布于微生物、植物和动物，但淀粉酶生产菌株主要来源于真菌和细菌，如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等,淀粉,糊精 + 低聚糖,淀粉酶,随机切断 1，4 糖苷键,-淀粉酶在工业中的应用,-

2、淀粉酶可有微生物发酵产生，也可从植物和动物中提取。目前，工业生产上都以微生物大量生产。主要的-淀粉酶生产菌种由细菌和曲霉，尤其是枯草杆菌为大多数工厂所采用。生产上有使用价值的产生菌有：枯草杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、凝聚芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、米曲霉、黑曲霉、拟内孢霉。,保藏菌种,斜面活化,摇瓶种子培养,厚层通风发酵,麸曲,烘干,抽提,粗制品,过滤,收集滤液,沉淀,离心,洗涤沉淀,风干,粉碎,精制品,种子罐扩大培养,-淀粉酶的工业化生产,-淀粉酶在工业中的应用,-淀粉酶在食品工业中应用广泛，涉及制糖、冷饮、面包、啤酒、酒精工业等多方面。,食品工业,制糖：双酶法生产麦芽低聚糖；耐高温-

3、淀粉酶应用到到超高麦芽糖浆生产；,冷饮：在制作冷饮的过程中，由于淀粉糊在低温静置的时候会形成不溶性的硬性凝胶块，从而导致冷饮的口感不佳。加入-淀粉酶能使冷饮黏度降低，流动性增高，保证高淀粉冷饮的口感，使其更适合于人们的口感。,面包： 适量的-淀粉酶可改良面包的品质。,啤酒、酒精工业： -淀粉酶热稳定性是由蛋白质本身的热稳定性决定的，所以该酶被广泛应用于啤酒酿造和酒精工业等。,淀粉酶在现代工业生产中广泛应用于食品工业、水洗工业、造纸工业、医药业、饲料业。,-淀粉酶在工业中的应用,-淀粉酶用于去除水洗工业中添加的淀粉,水洗工业,由于淀粉廉价、易获取、易去除，所以在现代纤维制造工艺中被用作为防止纱线

4、断裂而加的一层保护层材料，之后再使用-淀粉酶进行处理，其能有选择性地去除淀粉浆而不伤害纱线纤维，还能使淀粉降解为易溶于水的糊精，使其容易被洗掉。,淀粉酶在现代工业生产中广泛应用于食品工业、水洗工业、造纸工业、医药业、饲料业。,-淀粉酶在工业中的应用,-淀粉酶在造纸工业中主要用来改良纸张涂层淀粉的黏度和浓度,造纸工业,淀粉酶在现代工业生产中广泛应用于食品工业、水洗工业、造纸工业、医药业、饲料业。,浆糊是一种很好的纸张涂料，其能提高纸张的硬度和强度、增强纸张的可摩擦性；在生产纸张时为了在处理过程中让其免于机械损伤，会在处理时涂上浆糊。当纸张穿过2个轧辊时，淀粉浆被加入纸张中，这个过程的温度控制在4

5、560 ，需要淀粉有稳定的黏度。而自然界的淀粉浓度对于纸张上浆来说太高，因此，可以用-淀粉酶部分降解淀粉来调节。,-淀粉酶在工业中的应用,-淀粉酶在医药业中用于疾病检测、医药研制等,医药业,淀粉酶在现代工业生产中广泛应用于食品工业、水洗工业、造纸工业、医药业、饲料业。,疾病检测：黄琛等对乳酸脱氢酶、- 淀粉酶、癌胚抗原进行了联合检测。通过临床试验证明，将这3种酶进行联合检测，以其中任意两项为联检阳性，就可以提高卵巢癌的阳性检出率，弥补各种单项检查在卵巢血清学诊断中灵敏度较低的不足，并有助于卵巢 癌与卵巢良性肿瘤的鉴别诊断。,医药研制：黑曲霉-淀粉酶具有耐酸性，故可用来制造帮助消化一类的药物，开

6、发适合于胃酸性环境的耐酸性-淀粉酶，用于制备消化助剂，将会使医疗效果更为有效。麦 角隐亭是用于治疗高血压和处理外周血管组织障碍具有药理活性的生物碱，可通过-淀粉酶处理淀粉的水解液作为碳源，来发酵培养麦角菌TCC20019，生产麦角隐亭。,-淀粉酶在工业中的应用,饲粮中添加外源-淀粉酶可以帮助幼龄动 物消化利用淀粉，对其生长性能与饲料转化率十分 有益,饲料业,淀粉酶在现代工业生产中广泛应用于食品工业、水洗工业、造纸工业、医药业、饲料业。,饲料业：在饲料中添加以蛋白酶、-淀粉酶为主的复合酶制剂，可以提高断奶仔猪的生产性能和营养物质的消化率。肉鸡日粮中添加产-淀粉酶的活大肠杆菌培养物可以起到抗生素生

7、长促进剂的作用，改善肠道形态，提高生产性能。有研究在肉鸡日粮中添加不同剂量外源-淀粉酶，均提高了肉鸡增重，每多添加淀粉酶1 000 Ukg-1，每羽肉鸡多增重约10 g，并提高了21日龄肉鸡前肠内容肠淀粉酶，总蛋白酶和胰蛋白酶活性。,地衣芽孢杆菌制-淀粉酶,地衣芽孢杆菌(Baci llus Licheniformis) 是一种在土壤中常见的革兰氏阳性嗜热细菌。地衣芽孢杆菌细胞形态和排列呈杆状、单生，可调整菌群失调达到治疗目的，可促使机体产生抗菌活性物质、杀灭致病菌。能产生抗活性物质，并具有独特的生物夺氧作用机制，能抑制致病菌的生长繁殖。,地衣芽孢杆菌(Baci llus Licheniform

8、is)是产生一种具有重要工业生产价值的-淀粉酶的优良菌株。一般自然界中存在的野生型菌株的-淀粉酶产量很低，如何提高菌株的产酶性能是普遍关心的问题。目前工业化生产所使用的菌株大多是以野生菌株为出发菌株经过反复诱变得到的突变株，在实际生产过程中存在着易污染、生产条件复杂且难以控制等技术性难题。如何有效解决这些问题成为当前生产淀粉酶制剂工业的关键性问题。,地衣芽孢杆菌制-淀粉酶,菌种改良的具体措施很多，微生物菌种的育种手段和技术从最早人们认为的微生物可“驯化”，到出现了“定向培育”技术；再到后来随着对遗传变异现象认识的深入，出现了通过诱变剂提高诱变频率的育种技术。 现代分子生物学技术的飞速发展,为菌

9、种改良开辟了一条新途径。基因工程所创造的新物种是超远缘杂交,是最新最有前途的育种方法。,菌 种 改 良,诱变育种：,基因工程：,常选用紫外线(UV)、亚硝基胍(NTG)、 甲基磺酸乙酯(EMS)等诱变方法。,利用分子生物学和基因工程的手段和方法对地衣芽孢杆菌的基因进行诱变。,盲目性、 程度有限、 耗时长、 效果不明显,目标准确、耗时短、见效快,地衣芽孢杆菌制-淀粉酶,-淀粉酶在地衣芽孢杆菌宿主菌中的分泌表达 （参考 陈敬帮, 周银华, 赵新宇,等. -淀粉酶在不同地衣芽孢杆菌宿主菌中分泌表达的对比分析J. 食品科学, 2015, 36(17):196-200.）,-淀粉酶分泌表达载体构建,-淀

10、粉酶重组表达菌株的构建,重组发酵菌株的发酵培养,产物-淀粉酶的分离纯化,地衣芽孢杆菌制-淀粉酶,以枯草芽孢杆菌的P43启动子，以地衣芽胞杆菌-淀粉酶基因的信号肽、编码区和终止子序列为表达原件，构建了-淀粉酶分泌表达载体pP43SAT。,-淀粉酶分泌表达载体构建,地衣芽孢杆菌制-淀粉酶,接种地衣芽胞杆菌于LB培养基，37 、180 r/min过夜培养后，转接至电转化生长培养基中，250 r/min、37 培养至OD600 nm为0.80.9，冰浴10 min，5 500 r/min离心6 min，收集菌体，用电转化洗涤培养基洗涤菌体3 次，重悬于洗涤培养基中，即为感受态细胞。取感受态细胞加入5

11、L pP43SAT质粒DNA（50 ng/L），转至预冷的电转化杯（0.2 cm）中，冰浴11.5 min，用电脉冲转化仪2.5 kV电击1 次，迅速加900 L电转化恢复培养基，37 水浴1 h，100 r/min恢复培养2 h，涂含有20 g/mL的四环素抗性平板，37 培养20 h，挑取转化子。,-淀粉酶重组表达菌株的构建,地衣芽胞杆菌（LB培养基）,37 、180 r/min过夜培养,地衣芽胞杆菌（电转化生长培养基）,250 r/min、37 培养 至OD600 nm为0.80.9,冰浴10 min，5 500 r/min离心6 min,菌体,用电转化洗涤培养基洗涤菌体3 次， 重悬于

12、洗涤培养基中,感受态细胞,用电脉冲转化仪 2.5 kV电击,pP43SAT质粒DNA,四环素抗性平板筛选,转化子,地衣芽孢杆菌制-淀粉酶,将重组发酵接种于含四环素（20 g/mL）的LB培养基中，37 、180 r/min培养过夜。再转接至新鲜的LB培养基中，直到OD600 nm为1.0时，以1%的接种量接种到新鲜的淀粉酶发酵培养基中，37 、180 r/min振荡培养。,重组发酵菌株的发酵培养,重组发酵菌株,接种到含四环素（20 g/mL） 的LB培养基中,37 、180 r/min培养过夜,转接至新鲜的LB培养基中，直到 OD600 nm为1.0时，以1%的接种量 接种到新鲜的淀粉酶发酵培

13、养基中,收集产物-淀粉酶,37 、180 r/min培养过夜,地衣芽孢杆菌制-淀粉酶,产物-淀粉酶的分离纯化,发酵液,6 层纱布过滤, 6 000 r/min离心15 min, 收集上清,粗酶液,调至pH至 6.0 ,冰浴 中无水乙醇沉淀,粗酶蛋白沉淀,离心、除乙醇、透析,透析后的酶液,CM52纤维素柱层析,-淀粉酶,干燥,1、碳氮源对发酵生产的影响 2、金属离子等无机离子对发酵生产的影响 3、生长因子对发酵生产的影响,1、温度的影响 2、pH 的影响 3、溶氧的影响,-淀粉酶产量的影响因素,培养基成分对发酵生产的影响,发酵条件的影响,其他影响因素,生产工艺流程等也会对产量有很大影响。,1、碳

14、氮源对发酵生产的影响 在 淀粉酶发酵生产中常用的碳源为可溶性淀粉或生淀粉，常用的氮源有酵母提取物、大豆粉、肉汁提取物、蛋白胨等。但是，从工业能耗和生产成本考虑，越来越多的生产厂家开始用一些低成本又能提供良好碳氮源的农业废料如麸皮、油饼来替代成本较高的可溶性淀粉、酵母膏和蛋白胨等精细碳氮源。尽管麸皮等残料在颗粒大小、碳氮比例上参差不齐，同时这类残料含有一些未知的杂质，然而这些替代品不但能提供丰富的营养，而且成本十分低廉，经过研究和优化可以成为良好的碳氮源。利用低成本的农业原料将是以后大规模发酵生产的趋势,常用的碳源为可溶性淀粉或生淀粉，氮源有酵母提取物、大豆粉、肉汁提取物、蛋白胨等,低成本的 农

15、业原料,考虑工业能耗 及生产成本,Saban等研究Bacillus amyloliquefaciensNRRL645 利用蓖麻油饼发酵生产淀粉酶时表明；会提高酶产量； Rajagopalan等以农业废料作为碳氮源，利用一株枯草芽孢杆菌KCC103 进行淀粉酶的深层液体发酵生产；表明会提高酶产量。 刘仲敏等在研究米曲霉ZLF13 固态发酵时发现麸皮中淀粉的含量会影响到最终 淀粉酶的产量。,-淀粉酶产量的影响因素-培养基成分对发酵生产的影响,2 、金属离子和其他无机离子对发酵生产的影响 淀粉酶是一种金属酶，在发酵过程中适当地加入一些金属离子对于 淀粉酶的产量有一定的促进作用。,常见的金属离子如K+

16、、Fe2 +、Mo2 +、Cl -等对于淀粉酶的产量基本没有影响; Mg2 + 则对产量起着关键的作用，在没有添加Mg2 + 的情况下产酶量会下降50%; Mn2 + 对于产量也会有一定的促进作用; 而Co2 + 可以使菌体量大大增加但是会导致产量有一定的下降,3、生长因子对发酵生产的影响 一些微量的生长因子对于产量有着重要的影响。,有些氨基酸如组氨酸、缬氨酸、赖氨酸和酪氨酸对酶的产量起阻碍作用，而半胱氨酸增加酶产量。 B 族维生素添加到培养基后酶产量也有明显提高，影响最大的是维生素B1和B6。 一些表面活性剂对产量也有一定的影响，如SDS 对产量起促进作用，而其他的表面活性剂如吐温20、吐温80 等都