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1、微生物工程综合性大实验实验内容实验一 谷氨酸发酵系列实验实验二 青霉素发酵系列实验实验三 啤酒发酵系列实验实验四 酸奶发酵系列实验实验一 谷氨酸的发酵系列实验（一）谷氨酸菌种的制备一、实验目的了解发酵工业菌种制备工艺和质量的控制，为发酵实验准备菌种。二、实验原理菌种制备的主要是尽可能培养出高活性能满足大规模发酵需要的纯种，主要纺纱方式为：分离纯化和扩大培养。一般2个月分离纯化一次，分两步进行。平板稀释法分离出单细胞菌落；挑取若干单细胞菌落接种于试管斜面培养基，然后把这些菌株分别用三角瓶进行药瓶发酵实验，比较各菌株产酸的高低，选择产酸高的菌株供生产用。三、实验材料、仪器与试剂材料 谷氨酸棒杆菌仪
2、器 试管；三角瓶；烧杯；量筒；玻棒；PH试纸（PH5.59.0）；天平；立式高压蒸汽灭菌锅；培养箱；显微镜等试剂 无水乙醇；牛肉膏；葡萄糖；蛋白胨；可溶性淀粉；胰蛋白胨；酵母提取物；NaCl;5mol/L NaOH;1mol/L HCl;KNO3;K2HPO4H2O;MgSO47H2O;MnSO4H2O 。四、实验步骤（一）培养基的制备1）平板培养基葡萄糖0.1%；蛋白胨1%；牛肉膏1%；NaCI0.5%；琼脂2%（pH=7.0）配置50ml培养基，灭菌后倒2个平板。2) 一级种子培养基蛋白胨1%；酵母浸出粉0.5%；NaCI1%；（pH=7.0）用三角瓶配置100ml，高压灭菌20min。3
3、）二级种子培养基葡萄糖2.5%；尿素0.34%；3水磷酸氢二钾0.16%；7水硫酸镁0.043%；7水硫酸哑铁0.0002%；1水硫酸锰0.0002%（pH=7.0）用三角瓶配置100ml，高压灭菌20min。（二）菌种的制备1）用平板稀释法在平板培养基进行画线，分离出单细胞菌落；2）用接种环挑取若干个单细胞菌落接到一级种子培养基，置于控温摇床200r/min，振荡培养12h，温度为32。3）取10ml一级种子培养基接到二级种子培养基中，置于控温摇床200r/min，振荡培养12h，温度为33-34。附：二级种子质量要求1） pH在7.2左右；2） 残糖量在1.5%以下，其他同一级种子；3）
4、OD值净增加0.6。（二）谷氨酸发酵及控制一、实验目的了解发酵罐的操作，完成谷氨酸发酵的全过程操作。二、实验原理培养基、温度、pH值、通风、搅拌、泡沫等因素会对发酵过程产生重要影响，因此对重要的参数进行控制是顺利进行发酵的前提和保证。根据发酵菌种对温度、pH值的要求不同，因此在发酵过程中要采取不同的温度和pH，以使发酵过程能够顺利进行，从而达到预期的目标。适当的溶氧对微生物菌株的发酵过程具有重要的影响，保证一定的溶氧就必须对通风量及搅拌转速进行适当的调节。三、实验材料、仪器与试剂材料：谷氨酸发酵二级种子培养液；发酵培养基；谷氨酸发酵液不同发酵时间所取样品；谷氨酸发酵液。仪器：蒸汽发生器；发酵罐
5、及控制系统；空气压缩机；补料瓶；补料针；硅胶管；滴定管；滴定管架；电炉；烧杯；1000mL容量瓶、150mL锥形瓶；高速离心机；分光光度计；恒温水浴锅；三角瓶；小试管；烧杯；玻棒等。试剂：无水乙醇；葡萄糖；硫酸镁；磷酸氢二钾；氢氧化钾；糖蜜；硫酸亚铁；硫酸锰；尿素、消泡剂；去离子水；硫酸铜；亚甲基蓝；酒石硫钾钠；氢氧化钠；亚铁氢化钾；盐酸；L-谷氨酸分析纯；茚三酮；丙酮；酒精等。四、实验步骤（一）谷氨酸的中糖发酵及控制1清洗发酵罐，配制好5L发酵培养基，灭过菌的400ml40%尿素及400ml消泡剂；2对发酵罐进行空消；3加入5L的发酵培养基，对发酵罐进行实消；4在接种槽中加好酒精并点燃，把二
6、级种子培养基从接种口倒进发酵罐中进行发酵；5对谷氨酸发酵过程中各项指标进行测定及控制。u 温度的控制u 溶氧量的控制u 通气量的控制u OD值的测定 直接用分光光度计，在波长600nm下测得OD值；u pH值的测定 用pH试纸进行测定，pH要控制在7.1-8.2这个范围内；u 谷氨酸含量的测定u 还原糖含量的测定（二）谷氨酸发酵过程还原糖含量的测定a试剂配制（斐林试剂）甲液：五水硫酸铜3.5g，亚甲基蓝0.005g，用水溶解并稀释至100ml；乙液：酒石酸钾钠11.7g，氢氧化钠12.64g，亚铁氢化钾0.94g，用水溶解并稀释至100ml；0.1%标准葡萄糖溶液：取葡萄糖1g，用少量水溶解，
7、转至1000ml容量瓶中，加入5ml盐酸，用水稀释定容至1000ml，摇匀；b斐林试剂的标定甲、乙液各5ml，置于100ml锥形瓶中，加水10ml，从滴定管中预先加入约20ml0.1%标准葡萄糖溶液，摇匀。于电炉上加热至沸腾，在沸腾的状态下以每秒一滴的速度加入0.1%标准葡萄糖溶液，至蓝色刚好消失为终点。记录前后总共消耗的标准葡萄糖溶液的总体积。同法平行操作3次，取接近两次体积的平均值为V0。c滴定甲、乙液各5ml，置于100ml锥形瓶中，加入0.1mlV1发酵液，摇匀后于电炉上加热至沸腾，在沸腾状态下以每秒一滴的速度加入0.1%标准葡萄糖溶液，至蓝色刚好消失为终点。记录消耗的标准葡萄糖溶液的
8、总体积V2.d计算公式还原糖（以葡萄糖计g/100ml）=（V0- V2）C1/ V1100【V0 =29.1mL；C=0.1%；V1=0.1mL】（三）谷氨酸含量的测定a谷氨酸标准曲线的绘制u 标准样品的制备 L-谷氨酸纯品梯度稀释溶液：分别称取0.05-0.5g分析纯L-谷氨 酸,并分别溶解到100ml蒸馏水中，调节pH5.5-6。u 茚三酮试剂的制备 称取0.5g茚三酮溶于100ml丙酮。u pH调节试剂的制备 2mol/LNaOH溶液：称取80gNaOH溶于100mL蒸馏水中；1mol/L HCL溶液：量取36mL蒸馏水中。u 标准溶液OD569值的测定 取20支试管，分别加入3ml配
9、制好的（0. 05-0.50）g/100ml的L-谷氨酸纯品溶液各两管，每支试管分别沿试管壁加入茚三酮试剂0.5ml，摇匀，迅速置于80水浴，3min后，冰浴3min，将分光光度计波长调至569nm处，以蒸馏水为空白对照，用1cm玻璃比色皿比色，测出OD569值。以OD569值为纵坐标，绘制标准曲线。b发酵液谷氨酸含量测定谷氨酸发酵液11400r/min，离心5min，取上清，蒸馏水稀释100倍，调节pH值5.5-6，取3ml预处理好的发酵液加入15mm150mm试管，调整pH值5.5左右，沿试管壁加入0.5ml茚三酮试剂，混匀，迅速置于80水浴，3min后，冰浴3min，将分光光度计波长调至
10、569nm处，以100稀释的空白发酵培养基为空白对照，用1cm玻璃比色皿比色，测出OD569值。从标准曲线上查出相应L-谷氨酸浓度。结果与分析1、谷氨酸菌种的制备结果一级菌液OD600=0.239 pH=6.5二级菌液OD600=0.106 pH=7.02、谷氨酸含量的测定结果1）标准曲线数据：时间（h）013457891112131516温度3232323235.9pH6.426.567.388.578.94DO值102.082.22.72.62.3通风量2.52.42.43.023OD6000.2080.6411.3817.458.65还原糖含量滴定用量（ml）10.8还原糖含量（g/10
11、0ml）9.21谷氨酸含量（OD569）0.4谷氨酸含量（g/100ml）0.0892时间（h）1719202123242527282931323335温度35.935.936.036.0pH9.029.059.039.12DO值12.117.529.149.9通风量6.85.2504.8OD60010.1310.3510.6310.33还原糖含量滴定用量（ml）13.3014.6615.49还原糖含量（g/100ml）6.715.354.42谷氨酸含量（OD569）1.11.92.22.9谷氨酸含量（g/100ml）0.20560.33860.38840.5047时间（h）363719404
12、143444547484950温度35.835.935.935.9pH8.739.179.128.15DO值63.067.975.165.1通风量0.60.60.60.6OD6009.7411.849.339.66还原糖含量滴定用量（ml）16.5016.6217.9619.09还原糖含量（g/100ml）3.513.392.050.92谷氨酸含量（OD569）4.05.43.41.9谷氨酸含量（g/100ml）0.68760.92020.58790.33362）标准曲线绘制如下：3、谷氨酸发酵过程1）谷氨酸发酵上罐谷氨酸棒杆菌4、实验分析:4.1实验通过平板划线分离菌种的方法获得单个菌落，图
13、中可以看出，单菌落的形态、大小、颜色比较一致，可以用作一级、二级种子的培养。4.2谷氨酸发酵是建立在容易变动的代谢平衡上，受多方面的环境条件支配。环境适应，谷氨酸产生菌能将50%以上的糖转化为谷氨酸，副产品较少。如果环境条件不适宜，谷氨酸几乎不产生，可能会合成乳酸、琥珀酸等代谢产物。因此，需要对发酵过程进行严格控制。4.3温度对于发酵是非常重要的，从酶反应动力学来看，温度升高，反应速度加快，代谢产物速度提前。由谷氨酸发酵中温度及还原糖随时间变化曲线图可以看出，发酵过程中，温度严格控制在3036之间，在3236h内，温度大都接近36，符合谷氨酸发酵中温度的要求。从而，可以排除温度在发酵过程中对谷氨酸代谢产物合成的影响。4.4发酵过程中，营养成分的利用和代谢产物的积累，使发酵液的PH不断变化，若阴离子氮源被利用后产生NH3 ，则pH上升。有机酸的积累，使pH下降，培养基pH在发酵过程中能被菌体代谢所改变。而PH的变化又会间接影响到膜渗透性，进而影响到营养物质的吸收和代谢产物的分泌。所以，在谷氨酸发酵过程中，需控制好PH。谷氨酸发酵中PH及通风量随时间的变化曲线表明，PH通过尿素流加法，严格控制在6 8之间，
