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1、共聚焦显微镜 从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被观测物体上，如果物体恰在焦点上，那么反射光通过原透镜应当汇聚回到光源，这就是所谓的共聚焦，简称共焦。共焦显微镜Confocal Laser Scanning Microscope(CLSM或LSCM)在反射光的光路上加上了一块半反半透镜(dichroic mirror)，将已经通过透镜的反射光折向其它方向，在其焦点上有一个带有针孔(Pinhole)的挡板，小孔就位于焦点处，挡板后面是一个 光电倍增管(photomultiplier tube，PMT)。可以想像，探测光焦点前后的反射光通过这一套共焦系统，必不能聚焦到小孔上，会被挡板挡住。于是
2、光度计测量的就是焦点处的反射光强度。其意义是：通过移动透镜系统可以对一个半透明的物体进行三维扫描。 激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起来的一项具有划时代的高科技产品，它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率提高了30%-40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察诸如Ca2+ 、PH值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。激光共聚焦成像系统能够用于观察各种染色、非染色和荧光标记的组织和细胞等，观察研究组织切
3、片，细胞活体的生长发育特征，研究测定细胞内物质运输和能量转换。能够进行活体细胞中离子和PH值变化研究（RATIO），神经递质研究，微分干涉及荧光的断层扫描，多重荧光的断层扫描及重叠，荧光光谱分析荧光各项指标定量分析荧光样品的时间延迟扫描及动态构件组织与细胞的三维动态结构构件，荧光共振能量的转移的分析，荧光原位杂交研究（FISH），细胞骨架研究，基因定位研究，原位实时PCR产物分析，荧光漂白恢复研究（FRAP），胞间通讯研究，蛋白质间研究，膜电位与膜流动性等研究，完成图像分析和三维重建等分析。 一.激光共聚焦显微镜系统应用领域： 涉及医学、动植物科研、生物化学、细菌学、细胞生物学、组织胚胎、食品
4、科学、遗传、药理、生理、光学、病理、植物学、神经科学、海洋生物学、材料学、电子科学、力学、石油地质学、矿产学。 二.基本原理 传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面的每一点扫描，标本上的被照射点，在探测针孔处成像，由探测针孔后的光电倍增管（PMT）或冷电耦器件（cCCD）逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，
5、克服了普通显微镜图像模糊的缺点。 三.应用范围： 细胞形态学分析（观察细胞或组织内部微细结构，如：细胞内线粒体、内质网、高尔基体、微管、微丝、细胞桥、染色体等亚细胞结构的形态特征；半定量免疫荧光分析）；荧光原位杂交研究；基因定位研究及三维重建分析。 1.细胞生物学：细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动性、受体、细胞器结构和分布变化 2.生物化学：酶、核酸、FISH（荧光原位杂交）、受体分析 3.药理学：药物对细胞的作用及其动力学 4.生理学：膜受体、离子通道、细胞内离子含量、分布、动态 5.神经生物学：神经细胞结构、神经递质的成分、运输和传递、递质受体、离子内外流、神经组织结构、细胞分布 6.
6、微生物学和寄生虫学：细菌、寄生虫形态结构 7.病理学及临床应用：活检标本诊断、肿瘤诊断、自身免疫性疾病诊断、HIV等 8.遗传学和组胚学：细胞生长、分化、成熟变化、细胞的三维结构、染色体分析、基因表达、基因诊断 四.激光共聚焦显微镜在医学领域中的应用 A.在细胞及分子生物学中的应用 1. 细胞、组织的三维观察和定量测量 2. 活细胞生理信号的动态监测 3. 粘附细胞的分选 4. 细胞激光显微外科和光陷阱功能 5. 光漂白后的荧光恢复 6. 在细胞凋亡研究中的应用 B.在神经科学中的应用 1. 定量荧光测定 2. 细胞内离子的测定 3. 神经细胞的形态观察 C.在耳鼻喉科学中的应用 1. 在内耳
7、毛细胞亚细胞结构研究上的应用 2. 激光扫描共聚焦显微镜的荧光测钙技术在内耳毛细胞研究中的应用 3. 激光扫描共聚焦显微镜在内耳毛细胞离子通道研究上的应用 4. 激光扫描共聚焦显微镜在嗅觉研究中的应用 D.在肿瘤研究中的应用 1. 定量免疫荧光测定 2. 细胞内离子分析 3. 图像分析：肿瘤细胞的二维图像分析 4. 三维重建 E.激光扫描共聚焦显微镜在内分泌领域的应用 1. 细胞内钙离子的测定 2. 免疫荧光定位及免疫细胞化学研究 3. 细胞形态学研究：利用激光扫描共聚焦显微镜 F.在血液病研究中的应用 1. 在血细胞形态及功能研究方面的应用 2. 在细胞凋亡研究中的应用 G.在眼科研究中的应
8、用 1. 利用激光扫描共聚焦显微镜观察组织、细胞结构 2. 集合特殊的荧光染色在活体上观察角膜外伤修复中细胞移行及成纤维细胞的出现 3. 利用激光扫描共聚焦显微镜观察视网膜中视神经细胞的分布以及神经原的树枝状形态 4. 三维重建 H. 激光扫描共聚焦显微镜在肾脏病中的应用 可以系统观察正常人肾小球系膜细胞的断层扫描影像及三维立体影像水平，使图像更加清晰，从计算机分析系统可从外观到内在结构，从平面到立体，从静态到动态，从形态到功能几个方面对系膜细胞的认识得到提高。共聚焦显微镜商业化的共聚焦（共轭焦显）显微镜（英语：Confocal microscope）分三类： 共聚焦激光扫描显微镜（英语：Co
9、nfocal Laser Scanning Microscope，CLSM，LSCM） 转盘共聚焦显微镜（英语：Spinning-disk (Nipkow disk) confocal microscopes） 可编程序阵列显微镜（英语：Programmable Array Microscopes (PAM)）基本原理从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被观测物体上，如果物体恰在焦点上，那么反射光通过原透镜应当汇聚回到光源，这就是所谓的共聚焦，简称共焦。共焦显微镜在反射光的光路上加上了一块半反半透镜（dichroic mirror），将已经通过透镜的反射光折向其它方向，在其焦点上有一个带有针
10、孔（Pinhole），小孔就位于焦点处，挡板后面是一个光电倍增管（photomultiplier tube，PMT）。可以想像，探测光焦点前后的反射光通过这一套共焦系统，必不能聚焦到小孔上，会被挡板挡住。于是光度计测量的就是焦点处的反射光强度。其意义是：通过移动透镜系统可以对一个半透明的物体进行三维扫描。这样的构想，是在1953年， 美国学者马文明斯基提出，经过了30年的发展，才利用激光为光源，发展出符合马文明斯基理想的共轭焦显微镜。相关应用全内反射萤光显微镜TIRF Microscope海德堡视网膜地形图(HRT)，以此原理对视网膜，特别是视盘，进行分层的扫描，以重建视盘的三维结构。主要用于
11、青光眼的诊断和随访激光共聚焦显微镜的原理与应用范围激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和 装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。把光学成像的分辨率提高了30%40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。1 激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）的原理从基本原理上讲,共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜,它对普通光镜从技术上作了以下几点改进:11用激光做光源因为激光的单色
12、性非常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了色差。1 2采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板,将焦平面以外的杂散光挡住,消除了球差;并进一步消除了色差1 3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点,用十分细小的激光束(点光源)逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。14用计算机采集和处理光信号,并利用光电倍增管放大信号图在共聚焦显微镜中,计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像,得到的图像是数字化的,可以在电脑中进
13、行处理,再一次提高图像的清晰度。而且利用了光电倍增管,可以将很微弱的信号放大,灵敏度大大提高。由于综合利用了以上技术。可以说是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合,是现代技术发展的必然产物。2 在生物医学研究中的应用目前,一台配置完备的在功能上已经完全能够取代以往的任何一种光学显微镜,它相当于多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合,如倒置光学显微镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜()、微分干涉差显微镜()等,因此被称为万能显微镜,通过它所得到的精细图像可使其他的显微镜图像无比逊色。21观察活细胞、活组织在不损伤细胞的前提下,对活组织、活细胞进行观察和测量，这不仅省
14、去了繁琐的样品前期处理过程(如脱水、脱蜡、染色等);而且观察过的样品还可以继续用于其他的研究。这种功能对于细胞培养、转基因研究尤为重要。这可以说是最大的优势。22 生化成分精确定位观察配合专用的分子探针,对于要检测的成分不仅可以定位到细胞水平,还可以定位到亚细胞水平和分子水平23 动态观察在同一样品平面上随时间进行连续扫描,就可分析细胞结构、内含、和标记等动力学变化。目前在这方面做得最多的是使用观察心肌或平滑肌细胞内游离钙、钠、钾离子浓度或的动态变化。24 数据、图像的数字化用计算机代替了普通的照相机,得到的图像是数字化的,可及时输出或长期储存,而且还可进一步加工处理。25 定量测量首先应用专
15、一的荧光探针对样品进行染色,样品的荧光强度和所测成分的含量呈正比,如果其余条件固定,通过对比各组样品之间的荧光强度值,可得出特定成分的含量比。3 激光扫描共聚焦显微镜的使用（cAMP在体测量为例）31样品制备311切片 实验标本要求单层，并能很好地贴附在样品池中。所以，组织标本无论是石蜡切片还是冰冻切片，均为越薄越好。常用的贴附剂有：多聚赖氨酸，伴刀豆球蛋白，蛋清，琼脂明胶cell-Tak, vectabond等。312培养细胞 培养细胞可以满足要求，如果用购置仪器时所带的薄底培养瓶进行培养则更佳313激光共聚焦观察样品处理注意事项首先要尽量保持生物材料的天然状态，避免赝像、变形和失真，因此须将生物材料做固定处理；制片必须薄而透明，才能在显微镜下成像，除将材料切成薄片或通过轻压或其他手段使之分散外，还需采用其他方法使它透明和染色，以便更好地观察到结构的细节。需长期保存的制片，还应进行脱水和封固。 显微制片法一般包括切片法、整体封片法、涂片法和压片法4类。32荧光探针的选择荧光探针的发
