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1、天津医科大学 硕士学位论文 以AAV为载体的RNAI在沉默膀胱癌5637细胞E2F3基因中的应用 姓名：梁恩利 申请学位级别：硕士 专业：外科学 泌尿外 指导教师：吴长利 20100501 天津医科大学硕士学位论文 中文捅要 膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，在发达国家及地区较常见，也是我 国临床上最常见的恶性肿瘤之一，是一种直接威胁患者生存的的疾病。膀胱癌 中最常见的病理类型为移行细胞癌。膀胱移行细胞癌的恶性生物学特性包括： 多灶性、多基因参与、多阶段异质性生长、易复发、转移等。近年其发病率呈 上升趋势，且容易复发，并易转变为浸润型恶性肿瘤，目前的治疗主要包括手 术和术后腔内灌注抗癌药物。尽
2、管术后膀胱内化学、生物免疫治疗可预防和延 缓其复发和进展，然而膀胱移行细胞癌易复发和对化疗药物的耐药性一直是临 床治疗的棘手难题之一。随着分子生物学的发展，基因治疗已经成为人类战胜 肿瘤最有希望的手段，经过近2 0 多年的发展基因治疗己被认为是继手术、化疗 等常规治疗方法之后极有希望成为有效治疗膀胱移行细胞癌的方法之一。目前 基因治疗中有效的靶点及治疗方法的选择是基因治疗应用于临床的障碍，而 R N A 干扰( R N Ai n t e r f e r e n c e ，R N A i ) 的发现为寻找基因治疗的靶点带来了新思 路。 R N A i 是生物进化过程中普遍存在的保守的现象，它是由
3、小的、双链的R N A 所激发，通过对靶基因的m R N A 的降解所导致的基因转录后沉默。R N A i 是一 种非常保守的基因沉默机制。在原始生物中R N A i 能够保护基因组免受病毒或者 其它基因片段的插入，并且在生物的发育过程中调节众多基因的表达。短的双 链R N A 中的反义链与R N A 沉默诱导复合物相结合后能够与同源的m R N A 序列 特异性的结合，导致m R N A 切割断裂及随后出现的转录后水平基因表达的抑制。 所以R N A i 在人类基因组功能分析及肿瘤治疗中有诱人的前景。 肿瘤的发生发展与细胞周期调节失控密切相关。而E 2 F 3 是细胞周期调控过 程中起核心作
4、用的转录因子，其控制着细胞增殖过程( D N A 复制及细胞周期调控) 中众多基因的表达，是细胞合成间期中由G l 进入S 期所必需的转录因子。E 2 F 3 与视网膜母细胞瘤蛋白( R e t i n o b l a s t o m a p r o t e i n ，p R B ) 关系密切，在人类的众多 肿瘤中都存在R b 基因的失活，p R B 的主要功能就是通过对E 2 F 3 的调节而起生 长抑制作用。 腺相关病毒( a d e n o a s s o c i a t e dv i r u s ，A A 载体是近年来研究最为广泛、最受 关注的基因治疗载体。由于其宿主范围广、免疫原性低
5、、安全性高、稳定性好 等特点，A A V 载体被认为是未来基因治疗中最有希望的新一代病毒载体。至 天津医科大学硕士学位论文 今，A A V 载体己被用于携带各种不同抗血管生成基因进行动物肿瘤模型的治疗， 其结果显示具有非常好的应用前景。 目的：本试验应用A A V 载体的R N A i 的方法，以E 2 F 3 基因为治疗靶点进 行膀胱癌5 6 3 7 细胞基因治疗，观察能否有效调空细胞周期，诱导促进细胞凋亡。 方法：用A A V - H e l p e rf r e es y s t e m 包装系统，p R C ，p H e l p e r 质粒共转染， A A V - 2 9 3 细胞包
6、装腺相关病毒，采用“氯仿P E G N a C I 沉淀氯仿抽提”来进行 A A V 病毒的粗纯化、冰乙醇沉淀法浓缩腺相关病毒；用A V S a c h T ME L I S A 法测 定病毒r A A V 颗粒滴度；采用S D S P A G E 鉴定病毒后将r A A V s i R N A E 2 F 3 转染 入膀胱癌5 6 3 7 细胞株中。采用流式细胞术进行转染前后5 6 3 7 细胞细胞周期及 凋亡的变化情况。 结果：通过用A V S a c h T ME L I S A 法测定病毒r A A V 颗粒滴度为5 6 1 0 1 3 v p m L ；采用S D S P A G E
7、 鉴定病毒后，确定成功包装A A V 。转染后3 0 分钟即 可观察到绿色荧光的表达。流式细胞仪检测细胞周期数据结果：无处理细胞组 和空病毒组相比有统计学差异( P = 0 0 11 ) ；无处理细胞组和重组质粒组相比有统 计学差异( P = 0 0 0 1 ) ；空病毒组相和重组质粒组相比无统计学差异( P = 0 4 7 5 ) 。 流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示：空病毒组细胞凋亡比率为( 7 8 9 3 7 5 ) ， 重组质粒组细胞凋亡比率为( 2 4 2 4 7 ，7 6 ) 。 结论：r A A V 能够高效的转染膀胱癌5 6 3 7 细胞，重组质粒能够使肿瘤细胞阻 滞在G 1 期
8、，诱导膀胱癌细胞发生凋亡。本实验表明E 2 F 3 基因有可能成为膀胱 癌基因治疗的靶点，并有可能为后续的以E 2 F 3 为靶点的膀胱癌基因治疗体内实 验提供一定的理论依据。 关键词：膀胱癌；A A V 病毒；R N A 干扰；E 2 F 3 I I 天津医科大学硕士学位论文 A b s t r a c t B l a d d e rc a n c e ri st h em o s tc o m m o nu r o l o g i c a lm a l i g n a n tt u m o r , m o r ec o m m o n i nd e v e l o p e dc o u n
9、 t r i e sa n dr e g i o n s ，b u ta l s oo n eo ft h em o s tc o m m o nm a l i g n a n t t u m o ri no u rc l i n i c a la n dad i r e c tt h r e a tt ot h es u r v i v a l T h em o s tc o m m o n p a t h o l o g i c a lt y p eo fb l a d d e rc a n c e ri st r a n s i t i o n a lc e l lc a r c i n
10、 o m a I t sb i o l o g i c a l f e a t u r e s i n c l u d e ：m u l t i f o c a l ，m u l t i g e n ep a r t i c i p a t i o n ，m u l t i p h a s eh e t e r o g e n e o u s g r o w t h ，e a s yt or e l a p s ea n dm e t a s t a s i s I nr e c e n ty e a r s ，b l a d d e rt u m o r Si n c i d e n c e
11、i s o nt h e r i s e ， a n de a s yt o r e l a p s e ， a n de a s i l yt r a n s f o r m e di n t oi n v a s i v ec a n c e r O p e r a t i o ne s p e c i a l l yt r a n s u r e t h r a lr e s e c t i o no fb l a d d e rt u m o rh a sb e e nt h em a i n m e a s u r ei nt r e a t i n gb l a d d e rc
12、a n c e r A l t h o u g ht h eu s eo fi n t r a v e s i c a ld r u g ss u c ha s c h e m i c a ld r u ga n di m m u n er e v u l s i v eh a v eb e e nt h em o s ti m p o r t a n tp a r to f t r e a t i n g H o w e v e rt h e s e t h e r a p e u t i cm e t h o d sw eu s ec a n tc o n t r o lt h ep r
13、o g r e s s i o na n d r e c u r r e n c eo fb l a d d e rc a n c e ra n da tt h es a m et i m et h es i d ee f f e c t so f d r u g sa n dd r u g f a s ti np a t i e n t sr e m a i nt h et o u g hp r o b l e m F o rm o r et h a nt w e n t yy e a r sr e s e a r c h ，w t h t h ed e v e l o p m e n to
14、 fm o l e c u l a rb i o l o g y , g e n et h e r a p yh a sg r a d u a l l yb e c o m em a t u r e a n di s a c c e p t i n ga Se x t r e m e l yp r o m i s i n ga p p r o a c ht ot r e a t i n gC a n C e ra f t e rr e g u l a r t r e a t m e n ts u c ha So p e r a t i o n ，c h e m o t h e r a p ya
15、 n d r a d i o t h e r a p y A tp r e s e n ta no b s t a c l e t ot h ec l i n i c a la p p l i c a t i o no fg e n et h e r a p yi sav a l i d t a r g e tf o rg e n et h e r a p ya n d t r e a t m e n to p t i o n ，w h i l et h ed i s c o v e r yo ft h eR N A i n t e r f e r e n c e ( R N Ai n t e
16、 r f e r e n c e ， R N A i ) h a sb r o u g h tn e wi d e a sf o rg e n et h e r a p y R N A ii sac o n s e r v e dm e c h a n i s mf o rs i l e n c i n gg e n ee x p r e s s i o ni nt h ep r o c e s so f b i o l o g i c a le v o l u t i o np h e n o m e n o n ，i ti sas m a l l ，d o u b l e s t r a n d e dR N Aw h i c hi s s t i m u l a t e dt h r o u g ht h ed e g r a d a t i o no fm R N Ac a u s e db yp o s t t r a n s c r i p t i o n a lg e n e s i l
