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1、 本科学生实验报告本科学生实验报告仅供参考责任自负学号 104120440 姓 名 孙 永 升 学院 生命科学学院 专业、班级 10生物技术 实验课程名称 酶 工 程 教师及职称 李 俊 俊 开课学期 2012 至 2013 学年 第二学期 填报时间 2013 年 4 月 9 日 云南师范大学教务处编印实验名称实验方式小组成员实验一、纤维素酶活力测定小组合作XXXXXXXX1、 实验目的1.1学习并了解纤维素酶的基本特性；1.2学习酶活力的测定方法；1.3学习还原糖的测定、标准曲线的制作及分光光度计的使用方法；1.4学会对实验数据的处理及实验报告的撰写；2、 实验仪器、试剂和溶液：A 2 仪器
2、：A 2.1 滤纸酶活力(FPA)的测定中仪器：除普通实验室仪器外，还应有:分光光度计、酸度计精度士0.01 pH、恒温水浴(50士0.l)0C、分析天平感量0.1mg、磁力搅拌器、秒表或定时钟、沸7k洛(可用800W 申炉和高脚烧杯、楠夸量杯或茸楠奔器切成)、具塞刻度试管25mL。A 2.2 羧甲基纤维素(还原糖法)酶活力(CMCA-DNS )测定中仪器：自动连续多档分配器、漩涡混合器试管、水浴等仪器同A 2.1 B 2 试剂和溶液 (除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。)B 2.1葡萄糖标准曲线制备： 葡萄糖标准贮备溶液(10mg/mL)：称取于
3、 ( 103士2)下烘千至恒重的无水葡萄糖1g ,精确至0.1mg，用水溶解并定容至100mL, 葡萄糖标准使用溶液：分别吸取葡萄糖标准贮备溶液0.00 ,1. 00 ,1. 50 ,2. 00,2. 50,3. 00,3 .50mL于10mL容量瓶中，用水定容至10 mL，盖塞，摇匀备用。上述系列浓度应根据需要自行调整。B 2.2 滤纸酶活力(FPA)的测定中用到的试剂和溶液： DNS试剂：称取 3,5 一二硝基水杨酸(10士0.1) g，置于约600mL水中，逐渐加入氢氧化钠l0g，在50水浴中(磁力)搅拌溶解，再依次加入酒石酸甲钠200 g、苯酚(重蒸)2g和无水亚硫酸钠5g，待全部溶解
4、并澄清后，冷却至室温，用水定容至1000mL，过滤。贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7d后使用。 柠檬酸缓冲液，0.05 mol/L pH4 .8(适用于酸性纤维素酶)：称取 一 水 柠檬酸4.83g ,溶于约750m L水中，在搅拌情况下，加入柠檬酸三钠7.94g,用水定容至1000 mL。调节溶液的pH到(4.8士0.05)备用。 磷酸缓冲液，0.1m ol/L pH6 .0 (适用于中性纤维素酶)：分别称取一水磷酸二氢钠121.0g和二水磷酸氢二钠21.89g，将其溶解在10L去离子水中。调节溶液的pH到(6.0士0.05)备用。溶液在室温可保存一个月。 快速定性滤纸(杭州新华一号滤纸)
5、沪15 cm(每批滤纸，使用前用标准酶加以校正)。B 2.3羧甲基纤维素(还原糖法)酶活力(CMCA-DNS )测定用到的试剂和溶液： 竣甲基纤维素钠(CMC-Na)：化学纯(上海光华化学试剂厂)在25,2 %水溶液，粘度800m Pa.s-1200m Pa.so (每批羧甲基纤维素钠使用前用标准酶加以校正)。 柠檬酸钠缓冲液，同上。 磷酸缓冲液，同上。 CMC-Na溶液：称取2g CMC-Na,精确至1mg，缓缓加入相应的缓冲液约200mL并加热至800-900，边加热边磁力搅拌，直至CMC-Na全部溶解，冷却后用相应的缓冲液稀释至300 mL，用2 mol/L盐酸或氢氧化钠调节溶液的pH到
6、(4.8士0.05)(酸性纤维素酶)或(6.0士0.05)(中性纤维素酶)，最后定容到300 mL,搅拌均匀，贮存于冰箱中备用。 DNS试剂同上。3、实验原理及实验流程或装置示意图：A 3 滤纸酶活力(FPA)的测定原理:纤维素酶在一定温度和pH条件下，将纤维素底物(滤纸)水解，释放出还原糖。在碱性、煮沸条件下，3,5一二硝基水杨酸(DNS试剂)与还原糖发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖(以葡萄糖计)含量成正比。通过在540nm测其吸光度，可得到产生还原糖的量，计算出纤维素酶的滤纸酶活力。以此代表纤维素酶的酶活力。B 3 羧甲基纤维素(还原糖法)酶活力(CMCA-DNS )测定原理：纤维素酶在
7、一定温度和pH条件下，将纤维素底物(狡甲基纤维素钠)水解，释放出还原糖。在碱性、煮沸条件下，3,5一二硝基水杨酸(DNS试剂)与还原糖发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖(以葡萄糖计)含量成正比。通过在540 nm测其吸光度，可得到产生还原糖的量，计算出纤维素酶的CMCA-DNS酶活力。以此代表纤维素酶的酶活力。C 3 实验流程:葡萄糖标准曲线制作滤纸酶活力(FPA)的测定羧甲基纤维素(还原糖法)酶活力(CMCA-DNS )测定D 3 酶活定义D 3.1 纤维素酶：在各种酶组分的协同作用下，能降解纤维素，使之变成纤维寡糖、纤维二糖和葡萄糖的酶。D 3.2 滤纸酶活力Filterp apera c
8、tivity (FPA)lg 固体酶(或1mL液体酶)，在(50士0.1),指定pH条件下(酸性纤维素酶pH4.8，中性纤维素酶pH 6.0), lh水解滤纸底物，产生出相当于l mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位，以u/g(或 u/mL)表示。D 3.3 羧甲基纤维素酶活力 ( CMCA)D 3.3.1 还原糖法 lg固体酶(或1mL液体酶)，在(50士0.1)、指定pH条件下(酸性纤维素酶pH4 .8,中性纤维素酶pH 6.0), lh水解羧甲基纤维素钠底物，产生出相当于1 mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位，以u/g(或u/mL)表示。简写为CMCA-DNS。D 3.3.2 粘度
9、法 1g固体酶(或1mL液体酶)，在(40士0.1)、指定pH条件下(酸性纤维素酶pH6 .0， 中性纤维素酶pH7.5)，水解羧甲基纤维素钠底物，使底物粘度降低而得到的相对于标准品的纤维素酶相对酶活力。简写为CMCA-VIS 。4、实验方法步骤、操作流程及注意事项：A 4葡萄糖标准曲线制备流程：A 4.1绘制标准曲线的方法A 4.1.1先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定它们的吸光度A。A 4. 1.2浓度c为横坐标，OD为纵坐标，则得到一条拟合度较好的直线，称为标准曲线。A 4.1.3然后使用用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线
10、上找出对应的被测溶液浓度或含量。A 4.1.4 0.1%葡萄糖标准曲线的制作流程：如表一：取7支试管，编号，按照下表进行操作：如表一所示试管编号012345葡萄糖溶液体积（ml）0.00.20.40.60.81.0葡萄糖含量（mg）0.00.20.40.60.81.0缓冲液（ml）2.01.81.61.41.21.0DNS (ml)333333定容总体积(ml)151515151515OD（540nm） （葡萄糖标准贮备溶液的浓度为1mg/ml。） 表一B 4滤纸酶活力(FPA)的测定步骤:B 4.1 待测酶液的制备：称取同体酶样1g ,精确至0.1mg(或吸取液体酶样1mL，精确至0.01
11、mL)，用水溶解，磁力搅拌混匀，准确稀释定容(使试样液与空白液的吸光度之差恰好落在0.3-0.4范围内)，放置10 min，待测。（本实验中已提前稀释到200倍。）B 4.2 滤纸条的准备：将待用滤纸放入(硅胶)干燥器中平衡24h:将水分平衡后的滤纸制成宽1cm 、质量为(50士05)mg的滤纸条，折成M型备用。B 4.3 操作步骤:取三支25mL刻度具塞试管(一支空白管，二支样品管)。实验中分为两组：pH 4.8与pH 6.0。pH 4.8酶液稀释到1000倍，pH 6.0酶液稀释到5000倍。将折成M型的滤纸条，分别放入每支试管的底部沿lcm方向竖直放入)。分别向四支管中，准确加入相应pH
12、的缓冲溶液1 .50 mL。分别准确加入稀释好的待测酶液0.50mL于三支样品管中(空白管不加)，使管内溶液浸没滤纸，盖 塞 。 将三支试管同时置于(50士0.1)水浴中，准确计时，反应60min，取出。立即准确地向各管中加入DNS试剂3.0mL。再于空白管中准确加入稀释好的待测酶液0.5 0 mL,摇匀。将四支管同时放入沸水浴中，加热10min,取出，迅速冷却至室温，加水定容至25mL,摇匀。以空白管(对照液)调仪器零点，在分光光度计波长540nm下，用10mm比色杯，分别测量二支平行管中样液的吸光度。取平均值。以吸光度平均值查标准曲线或用线性回归方程求出还原糖的含量 。C 4羧甲基纤维素(
13、还原糖法)酶活力(CMCA-DNS )测定操作步骤：C 4 .1待测酶液的稀释：实验前已将酶液稀释到10000倍。C 4 .2操作步骤:取三支25mL刻度具塞试管(一支空白管，三支样品管)。实验中分为两组：pH 4.8与pH 6.0。pH 4.8酶液稀释到1000倍，pH 6.0酶液稀释到5000倍。分别向四支管中，准确加入用相应pH缓冲溶液配制的CMC-Na溶2.00mL。分别准确加入稀释好的待测酶液0.50 mL于三支样品管中(空白管不加)，用漩涡混匀器混匀，盖塞 。将四支试管同时置于(50+0.1)水浴中，准确计时，反应30min，取出。迅速、准确地向各管中加入DNS试剂3.0mL，于空
14、白管中准确加入稀释好的待测酶液0.5 0 mL,摇匀。将四支管同时放入沸水浴中，准确计时，加热10min，取出，迅速冷却至室温，用水定容至25mL。以空白管(对照液)调仪器零点，在分光光度计波长540nm 下，用10mm比色杯，分别测量三支样品管中样液的吸光度，取平均值。通过查标准曲线或用线性回归方程求出还原糖的含量。D 4 .3 滤纸酶活力(FPA)的测定步操作流程：如表二所示：操作步骤空白管样品管A样品管B步骤1试管底部放入折好的M型滤纸条步骤1加入相应pH的缓冲液1.5 mL（实验中两个pH梯度pH 6.0与pH 4.8）步骤2稀释酶液至所需测定倍数（原酶液为200倍pH 4.8为1000；pH 6.0为5000）步骤3加入待测酶液0.5 mL加入待测酶液0.5 mL步骤450精确保温60min步骤5加入3mLDNS试剂终止反应步骤6混合均匀步骤7加入0.5 mL待测酶液，沸水浴煮沸10min沸水浴煮沸10min沸水浴煮沸10min步骤8流水冷却至室温步骤9加蒸馏水定容至25mL，混匀步骤10OD540nm比色（注意：OD
