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1、分析化学,第9章 吸光光度法 Spectrophoto metry,返回,基本内容和重点要求,掌握物质对光的选择性吸收、吸光度和透光度、朗伯比耳定律及摩尔吸光系数等知识； 了解比色分析和分光光度法的特点、基本原理、仪器构造和各部件的作用； 学习显色反应和显色条件的选择； 理解分光光度法定量分析中各种影响因素； 了解紫外吸收光谱法的特点及应用。,返回,第9章 吸光光度法,9.1 吸光光度法基本原理 9.2 目视比色法及光度计的基本部件 9.3 显色反应及显色条件的选择 9.4 吸光度测量条件的选择 9.5 吸光光度法的应用 9.6 紫外吸收光谱法简介 9.7 分子发光分析法简介,返回,9.1 吸
2、光光度法基本原理,一、方法依据及分类 二、方法特点 三、光的基本性质 四、物质对光的选择性吸收 五、光的吸收基本定律朗伯比耳定律 六、偏离比耳定律的原因,返回,一、方法依据及分类,吸光（或分光）光度法：基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法，包括比色法、可见及紫外光度法及红外光谱法等。 比色分析法 通过目视比较颜色的深浅来测定物质的浓度。 吸光光度法 使用光度计测定的方法。,返回,二、方法特点,灵敏度高、选择性好 准确度较高 分析快速、仪器简单、操作简便 应用广泛,返回,三、光的基本性质,光的波动性和微粒性 电磁波谱图 单色光与复合光 互补色光,返回,1. 光的波动性和微粒性,返回,2.
3、 电磁波谱图,返回,3. 单色光与复合光,单色光：具有同一波长的光 复合光：不同波长组成的光 可见光的波长大约在400760nm之间，由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种色光按一定比例混合而成，各种色光具有一定的波长范围。,返回,4. 互补色光,如果把适当颜色的两种色光按一定强度比例混合，可以组成白光，这两种色光称为互补色光。,返回,四、物质对光的选择性吸收,物质颜色和吸收颜色的关系 双原子分子能级示意图 吸收光谱图 分析依据,返回,1. 物质颜色和吸收颜色的关系,返回,表9-1 物质颜色和吸收颜色的关系,返回,15,2. 双原子分子能级示意图,返回,16,返回,3. 吸收光谱图,最大吸收波长m
4、ax,返回,4. 分析依据,定性分析：最大吸收波长max 定量分析：吸光度大小,返回,五、光的吸收基本定律 朗伯比耳定律,透光度（率）与吸光度 朗伯比耳定律 吸光系数、摩尔吸光系数 吸光度的加合性,返回,1. 透光度（率）T与吸光度A,透光率或透射比,吸光度,Transmittance and Absorptivity,返回,透光度 T与吸光度A的关系,返回,2. 朗伯比耳定律,Lambert-Beers Law,A吸光度 K比例常数，与吸光物质的性质、入射光波长、温度等有关 b液层厚度，cm c溶液的浓度，molL-1或g L-1,返回,3. 吸光系数、摩尔吸光系数,吸光系数a： 摩尔吸光系
5、数（或）： 关系： M a,返回,例 1,50mL比色管中，加入含有0.025mg的Fe2+溶液，加入邻二氮菲显色剂，用水稀释至50mL，用2cm比色池，在分光光度计上测得吸光度A=0.190，计算摩尔吸光系数？ 解：,返回,4. 吸光度的加合性,多组分体系中,返回,六、偏离比耳定律的原因,标准曲线（校正曲线） 非单色光引起的偏离 化学因素引起的偏离 介质不均匀引起的偏离,返回,Standard curve，calibrated curve，working curve,（一）. 标准曲线（校正曲线）,返回,返回,（二）偏离原因 1. 非单色光引起的偏离,目前各种分光光度计得到的入射光实际上都是
6、具有某一较窄波段的复合光，物质对不同波长光的吸收程度的不同，因而导致对朗伯比耳定律的偏离。 克服非单色光引起的偏离的措施： 使用比较好的单色器； 人射光波长选择在被测物质的最大吸收处； 测定时应选择适当的浓度范围。,返回,2. 化学因素引起的偏离,稀溶液能很好服从比耳定律。 溶液中吸光物质常因解离、络合、缔合或互变异构等化学变化而形成新化合物或改变其浓度，因而导致偏离朗伯比耳定律。 在分析测定中，要控制溶液的条件，使被测组分以一种形式存在，以克服化学因素所引起的对朗伯比耳定律的偏离。,返回,9.2 目视比色法及光度计的基本部件,一、目视比色法 二、光度计的基本部件 三、方法比较,返回,一、目视
7、比色法（ Colorimetry ）,方法依据 用眼睛观察、比较溶液颜色深度以确定物质含量的方法。,返回,优点 仪器简单（或不需要）、操作简便，适宜于大批试样的分析。灵敏度高，因为是在复合光白光下进行测定，故某些显色反应不符合朗伯比耳定律时，仍可用该法进行测定。 缺点 准确度不高，标准系列不能久存，需要在测定时临时配制。,返回,二、光度计的基本部件,光源 单色器 吸收池 检测系统,返回,1. 光源,在可见光区，常用钨灯或碘钨灯作光源，它们辐射3202500nm波长的光； 在近紫外区，常使用氢灯或氘灯，它们能辐射180375nm波长的光。 具有足够的光强度，并能稳定。,返回,2. 单色器,滤光片
8、由有色玻璃片制成，只允许和它颜色相同的光通过，得到的是近似的单色光。 棱镜用光学玻璃或石英制成，光通过棱镜发生折射而色散。 光栅光通过光栅发生衍射和干涉现象而分光。,返回,3. 吸收池,也称比色皿，用于盛吸收溶液； 由无色透明的光学玻璃或石英制成； 液层厚度为0.5、1、2、3cm等的一套长方形比色皿。,返回,4. 检测系统,硒光电池或光电管或光电二极管阵列作检测器，检流计或毫伏表作读数装置。 另可配置记录仪、数字显示器及计算机等。,返回,紫外-可见分光光度计,双光束紫外可见分光光度计,9.3 显色反应及显色条件的选择,一、显色反应 二、显色反应的选择 三、显色条件的选择 四、显色剂,返回,一
9、、显色反应（ Color reaction ）,待测物质本身有较深的颜色，直接测定。 待测物质是无色或很浅的颜色，需要选适当的试剂与被测离子反应生成有色化合物再进行测定，此反应称为显色反应，所用的试剂称为显色剂（color reagent）。 显色反应的类型：主要有氧化还原反应和络合反应（最常用）两大类。,返回,二、显色反应的选择,灵敏度高，有色物质的应大于104； 选择性好，干扰少，或干扰容易消除； 有色化合物的组成恒定，化学性质稳定(至少保证在测量过程中溶液的吸光度基本恒定)； 显色剂在测定波长处无明显吸收，即显色剂对光的吸收与络合物的吸收有明显区别，要求两者的吸收峰波长之差（称为对比度）
10、大于60 nm。,返回,三、显色条件的选择,显色剂用量 酸度 显色温度 显色时间 干扰的消除 溶剂,返回,1. 显色剂的用量,M + R = MR （被测组分） （显色剂） （有色络合物） 为使显色反应进行完全，需加入过量的显色剂。但有些显色反应，显色剂加入太多，反而会引起副反应，对测定不利。 在实际工作中根据实验结果来确定显色剂的用量。,返回,返回,2. 酸度,M+HR=MR + H+ 影响显色剂的平衡浓度和颜色 影响被测金属离子的存在状态 影响络合物的组成 制作pH与吸光度关系曲线确定pH范围。,返回,3. 显色温度,显色反应大多在室温下进行；有些显色反应需加热至一定温度完成；有些有色物质
11、温度偏高时易分解。 制作温度与吸光度关系曲线确定显色温度范围。,返回,4. 显色时间,有些显色反应瞬间完成，溶液颜色很快达到稳定状态，并在较长时间内保持不变； 有些显色反应虽能迅速完成，但有色络合物的颜色很快开始褪色； 有些显色反应进行缓慢，溶液颜色需经一段时间后才稳定； 制作吸光度-时间曲线确定适宜时间。,返回,5. 干扰的消除,干扰物质本身有颜色或与显色剂反应，在测量条件下也有吸收，造成正干扰； 干扰物质与被测组分反应或与显色剂反应，使显色反应不完全，也会造成干扰； 干扰物质在测量条件下从溶液中析出，使溶液变混浊，无法准确测定溶液的吸光度。,返回,干扰的消除,加入络合掩蔽剂或氧化还原掩蔽剂
12、，使干扰离子形成无色络合物或无色离子； 选择适当的显色条件以避免干扰； 选择适当的光度测量条件； 分离干扰离子。,返回,6. 溶剂,有机溶剂降低有色化合物的解离度，提高显色反应的灵敏度。如在Fe(SCN)3的溶液中加入丙酮颜色加深； 还可能提高显色反应的速率，影响有色络合物的溶解度和组成等。,返回,四、显色剂,无机显色剂 有机显色剂 多元络合物,返回,1. 无机显色剂,无机显色剂不多，因为生成的络合物不稳定，灵敏度和选择性也不高，目前应用不多。 如用KSCN显色测铁、钼、钨和铌；用钼酸铵显色测硅、磷和钒等。,返回,2. 有机显色剂,有机显色剂分子中含有生色团和助色团。 生色团（chromoph
13、oric group）： 含不饱和键的基团，如偶氮基、对醌基和羰基等。这些基团中的电子被激发时需能量较小，可吸收波长400nm以上的可见光而显色。 助色团（auxochromic group）： 含孤对电子的基团，如氨基、羟基和卤代基等。助色团与生色团的不饱和键作用，使颜色加深。,返回,常用有机显色剂,常用2类： 偶氮类，如：偶氮胂(铀试剂) 强酸性溶液中测Th()、Zr()、U()等；在弱酸性溶液中测稀土金属离子。 三苯甲烷类，如：铬天青S： 测定Al3+等许多金属离子； 由如：结晶紫： 测定Tl3+。,返回,3. 多元络合物,三元络合物 离子缔合物 金属离子络合剂表面活性剂体系 杂多酸,返
14、回,多元络合物,由三种或三种以上的组分所形成的络合物。 目前应用较多的是由一种金属离子与两种配位体所组成的三元络合物。三元络合物在吸光光度分析中应用较普遍。,返回,三元配合物特性,（1）比较稳定，可提高分析测定的准确度和重现性。 如：Ti-EDTA-H2O2稳定性比Ti-EDTA和Ti-H2O2二元配合物的稳定性分别增强1000倍和100倍。,返回,（2）具有更高的灵敏度和更大的对比度。 如： V(V)、H2O2 的二元配合物，测钒灵敏度低，而V(V)，H2O2和吡啶偶氮间苯二酚(PAR)形成1:1:1的有色络合物，用于钒的测定，其灵敏度高，最大吸收波长红移。,返回,（3）具有更高的选择性。
15、如： 铌和鉭都可以与邻苯三酚生成二元配合物，但在草酸中，只有鉭-邻苯三酚-草酸的黄色三元配合物形成。,返回,（4）可以改善显色条件。 如：有CTMAC（氯化十六烷基三甲基胺）存在时,Al3+与络天青S形成三元络合物比没有CTMAC时形成二元络合物的pH范围宽。等.。,返回,9.4 吸光度测量条件的选择,一、入射光波长的选择 二、参比溶液的选择 三、吸光度读数范围的选择,返回,一、入射光波长的选择,“最大吸收原则”（maximum absorption） 不仅灵敏度高，且能减少或消除由非单色光引起的对朗伯-比耳定律的偏离。 “吸收最大、干扰最小” 在最大吸收波长处有其他吸光物质干扰测定时选择。,
16、返回,返回,二、参比溶液的选择,参比溶液的作用： 调节仪器零点，消除由吸收池壁及溶剂、试剂等对入射光的反射和吸收造成透射光强度的减弱，使光强度的减弱仅与溶液中待测物质的浓度有关。 使用参比溶液校正： A=(I0/I) (I参比/I试液),返回,选择参比溶液的原则： 纯溶剂作参比液：仅待测物与显色剂的反应产物有吸收。 不加试样溶液的试剂空白作参比液：显色剂或其它试剂略有吸收。 不加显色剂的被测试液作参比液：显色剂为无吸收，被测试液中存在其他有色离子；若同时显色剂略有吸收，可在试液中加适当掩蔽剂掩蔽被测组分后再加显色剂作参比液。,返回,当A=0.434(或透射比T=36.8%)时，测量的相对误差最小。待测溶液的透射比T在15%65%之间，或使吸光度A在0.20.8之间，才能保证测量的相对误差较小。,返回,上一页,下一页,退出,三、吸光度读数范围的选择,为使测量结果得到较高的准确度，一般应控制标准溶液和被测
