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1、壳聚糖止血材料的制备及性能评价韦其全 潘峰 刘坤 材料学院2005级指导教师：李保强一、课题研究目的在日常生活中突发性事故的急救治疗，在医院对病人的手术过程中的创伤止血，特别是战争中受伤战士的救护，病患者的局部快速且有效的止血非常重要。因为未受控制的出血是导致突发事故，术中大出血或战场伤亡的主要原因。在伊拉克战争中，战场上有50%阵亡人员是由于出血过多导致的。尽早的控制出血成为降低患者伤亡的最佳策略。创伤止血材料是应用于创伤出血救治，是平战时救护常用的物品，创伤止血材料的研究对于战创伤救治具有重要意义，临床常用的止血材料如止血纱布、止血绷带存在着局限性：如止血时间较长、易与伤口粘连而不易换药、
2、对伤口的感染和化脓无能为力。快速止血和功能性止血将是未来止血药物发展的方向。目前，以壳聚糖为原料的止血材料正成为国内外研究的热点之一。我们希望通过对近年来国内外研制的新型快速止血材料的成分和止血机制的研究，制备一种高效的快速止血材料。二、课题背景美国HemCon公司推出的以冻干壳聚糖为基质的止血绷带（HemCon Bandage）能迅速止住大量出血，这种已消毒的绷带的柔韧性好, 可供军队战斗时使用, 甚至在极其恶劣的天气和地形亦可使用, 它可使伤口形成结实的有粘附性的血块, 然后转运伤员。美国俄勒冈州的萨姆医疗产品公司以其从虾壳中提取出来的一种颗粒状混合物CLEOX命名的CLEOX止血粉，能迅
3、速止住动脉出血，再出血率为零。壳聚糖基止血材料在制备与性能检验方面存在以下问题：首先单一组分壳聚糖止血材料存在效果不显著；其次壳聚糖或壳聚糖/胶原、壳聚糖/明胶复合膜的柔韧性差，且存在成膜率低的问题；最后很少文献报道了止血材料的力学性能，而这恰恰直接关系到使用止血材料时的可操作性（如拉伸或延展性能）。李保强等研究表明，壳聚糖/羧甲基壳聚糖混合能成功制得止血薄膜，但存在机械性能不理想，止血评价不完善等问题。 基于壳聚糖止血材料的现状和问题，我们提出了通过溶液浇注制备甘油改性的CS/CMCS复合载药膜的方法，其中通过加入甘油以改善复合膜的柔韧性，加入酚磺乙胺为促进止血剂，研究止血剂对复合止血膜的力
4、学性能的影响，最后采用兔子耳朵出血模型评价复合止血材料效果。三、课题研究主要内容1. 原料壳聚糖、羧甲基壳聚糖（青岛海汇生物工程有限公司）、乙酸（天津）、甘油、酚磺乙胺（新乡）、新西兰大白兔（购于哈尔滨兽研所）2. 复合膜制备过程1) 用电子天平称取4g壳聚糖（CS），将其溶于200ml的2%醋酸溶液，进行机械连续搅拌2h左右使其充分溶解，然后静置数小时脱泡；2) 用电子天平称取4g羧甲基壳聚糖（CMCS），将其溶于200ml蒸馏水，进行机械连续搅拌2h左右使其充分溶解，然后静置脱泡；3) 配置质量分数分别为10%，15%，20%，25%，30%的甘油50ml；4) 将上述三种溶液按16：4：
5、5混合，并滴加4%的盐酸调节pH为3左右，搅拌至澄清。5) 在步骤1.4中加入质量分数分别为0.5%，1.0%，1.5%的酚磺乙胺注射液；6) 采用溶液浇注膜的方法，将约40ml的混合液注入模具中，放入53的电热鼓风干燥箱中56小时，分别获得壳聚糖/羧甲基壳聚糖复合膜或载药的壳聚糖/羧甲基壳聚糖复合膜。3. 复合膜的成膜理论研究研究了甘油对成膜的影响，分析了在成膜过程中的重要作用。4. 复合膜力学性能测试根据塑料薄膜拉伸性能试验方法（GB13022-91），将试样剪成如图1所示的哑铃形状(总长115mm)，用螺旋测微器测量试样厚度。然后将试样放置在试验环境下12h后开始试验。在电子万能材料实验
6、机（岛津电子万能拉力机）上，选用拉伸模式，测试速度25mm/min，拉伸标距80mm，测定试样的拉伸强度、断裂伸长率和模量。若试样断裂位置不在中间区域内，则数据无效，应重新实验，每个比例取七组有效数据，取平均值。 图1哑铃形试样图2拉断后的试样5. 复合膜中的含水量测定将复合膜放置在试验环境下24h以上后开始试验。1) 选择尺寸为100mm*50mm膜。在电子天平上量出其初始质量；2) 放入电热恒温鼓风干燥箱，保持恒温53；3) 每5分钟测量一次复合膜样品的质量并记录，当质量变化不大时（约30分钟后），时间间隔选为10分钟4) 当复合膜质量不再改变时，实验结束，依据公式（1）计算不同甘油含量的
7、复合膜含水率。（1），（其中W0为样品初始质量，Wt为t时刻样品重量）6. 复合膜的止血评价6.1 全血凝固时间用8号针头刺破兔子耳朵，吸取4ml的兔子静脉血液，将0.5ml新鲜的静脉血液涂覆在不同组分的壳聚糖/羧甲基壳聚糖止血膜表面，1min后将膜倾斜45度，直到血滴不流动为止，记录全血凝固时间。6.2 止血膜出血创面的止血时间利用解剖刀在新西兰大白兔上切出11cm2的耳部静脉出血创面和11cm2耳部动脉出血创面，用不同比例的止血膜处理创面，记录止血膜的止血时间和创伤愈合情况。四、结论（成果介绍）1. 复合膜外观性质采用溶液浇注的方法可获得浅黄色的壳聚糖/羧甲基壳聚糖复合膜，其厚度为30-5
8、0um。加入甘油后，复合膜柔韧性显著增加，且含量越高复合膜柔韧性增加，可以对折。此外甘油引入复合膜内，使其透明性增加。ABC图3 不同甘油含量的壳聚糖/羧甲基壳聚糖复合膜（a，0%，b，10%，c， 30%）表1 复合膜柔韧性比较甘油含量（wt%）颜色柔韧性0白色、不透明差、很脆、干燥时易开裂，成品率为零10浅黄色、半透明较差、干燥和取膜时易碎，成品率较低低30浅黄色、透明柔软，韧性好，可对折2. 复合膜的成膜理论研究含多羟基甘油的沸点（290），可与水以任何比例混溶，能降低水的冰点。有极大的吸湿性。甘油的饱和蒸汽压：0.017kPa at 25；1.18kPa at 81；而水的饱和蒸汽压：
9、2.63kPa at 22；49.22 kPa at 81。在膜烘干过程中（温度为50-60），根据蒸汽压的数据可知甘油的挥发可以忽略；即干燥过程是基于水和乙酸的挥发。这相当于干燥过程改变了溶剂组成，使溶剂内甘油含量逐渐增加，从而降低了溶剂的介电常数（图）。壳聚糖在低介电常数介质中的溶解度降低，使壳聚糖/羧甲基壳聚糖溶液逐步逼近临界凝胶点，促使溶液转变为凝胶。随着水的挥发进行，使溶剂的介电常数逐渐减小；另外混合酸的挥发使质子化的壳聚糖去质子化。溶剂介电常数和壳聚糖去质子化均降低了壳聚糖分子链的表观电荷密度，促使壳聚糖分子链凝聚，并使壳聚糖内残留的乙酰基逐渐形成疏水区域和分子间氢键。介电常数改变
10、意味着壳聚糖分子链表观电荷密度减低，易于形成凝胶。图4 甘油/水溶液的介电常数与溶剂组成之间的相互关系由于壳聚糖或壳聚糖/羧甲基壳聚糖膜的柔韧性差，易脆断，无法满足止血材料所要求的机械强度。基于干燥过程中溶剂组成改变的规律，提出加入甘油，促使在干燥过程中形成溶液-凝胶-膜的转变。随着干燥过程进行，不断变化的甘油含量调节了溶剂的介电常数，因此甘油在复合膜中起到介电常数调节剂的作用。复合膜的透明性主要依赖于复合膜组分的相容性，未添加甘油的复合膜在干燥过程中发生明显的相分离过程，而甘油引入后，出现的溶胶-凝胶转变延缓发生相分离程度，故添加的甘油的复合膜更加透明。3. 复合膜力学性能图5 甘油含量对复
11、合膜的拉伸强度的影响图6 甘油含量对复合膜的断裂伸长率的影响图7 甘油含量对复合膜的模量的影响甘油的引入不但显著改善了壳聚糖/羧甲基壳聚糖复合膜的柔韧性和透明性，它对复合膜的力学性能影响显著。图5、图6和图7分别为甘油含量对复合膜拉伸强度、断裂伸长率及其模量的影响。图5显示随着甘油含量的增加，复合膜的拉伸强度呈下降的趋势。甘油含量的增大，也使复合膜的断裂伸长率大大增加。甘油含量为30%的复合膜其断裂伸长率约是含量为10%的复合膜的10倍（见图6）。图7显示甘油含量的降低，弹性模量迅速增加，膜的抗变形能力增加，但脆性增大。即随着甘油含量的增加，尽管拉伸强度降低，但膜的柔韧性大幅提高，这将使得复合
12、膜的成品率大大提高。综合上述考虑，甘油的最佳百分比为15%-25%。因此甘油在复合膜中起到增塑剂的作用，并使复合膜韧性显著增加。由于甘油具有较大的吸湿性能，在药品中经常用作溶剂或润滑剂。复合膜含水率是影响复合膜力学性能的主要因素。随着复合膜内甘油含量增加，含水率也从10%增加到24%。甘油的存在使复合膜可以保存较多水分，从而使膜的延展性大幅增加。因此，甘油在复合膜中起到了保水剂作用。图8 不同甘油含量的复合膜含水率4. 酚磺乙胺对膜性能的影响酚磺乙胺（C10H17NO5S，分子量263.31）是一种包含磺酸基的盐（图9）。酚磺乙胺在水溶液中可产生阴离子磺酸根，这将阳离子壳聚糖提供离子交联的可能
13、。此外它能促使血小板循环量增加，增强血小板聚集性及粘附性，缩短凝血时间，加速血块收缩。适用于预防和治疗外科手术出血过多，是一种理想的止血添加剂。对含酚磺乙胺质量分数分别为0.5%，1.0%，1.5%的复合膜进行力学性能测试，图10、图11、图12分别为不同甘油/酚璜乙胺比例的复合膜的力学性能图，从中可以得出结论：加入酚璜乙胺不会明显降低复合膜的力学性能，符合实际操作所需要的强度。图9 酚璜乙胺分子式图10 不同甘油/酚璜乙胺比例对复合膜模量的影响 图 11不同甘油/酚磺乙比例胺对复合膜拉伸强度的影响图12 不同甘油/酚璜乙胺比例对复合膜模量的影响5. 复合膜止血性能评价5.1 复合膜处理静脉和
14、动脉出血创面在动物试验中，我们对酚磺乙胺质量分数分别为0，0.5%，1.0%的复合膜进行止血评价。在血液接止血膜时，不需要进行压迫，我们就可以马上看到止血膜迅速吸附在血液上，血液中水分被吸收，止血膜皱起成波浪状。随后血液凝固，止血迅速。图13 兔子耳部出血创面的模型 图14 止血前 图15 实施载药的甘油改性的复合膜处理通常兔子自身出血后大约240s后能够自行止血，这会造成自身大量的血液流失，并会危机生命。而采用壳聚糖/羧甲基壳聚糖复合膜干预出血后，其止血时间缩短为70s或120s。引入0.5wt%的酚磺乙胺后，其止血时间进一步缩短了26%和48%，均在52-63s内实现止血。随着酚磺乙胺增加
15、到1wt%，复合膜止血时间为110s左右，比未干预止血缩短1/2。因此止血添加剂酚磺乙胺确实起到了提高止血性能的效果。表3 11cm2静脉出血伤口的止血时间甘油含量（wt%）酚磺乙胺含量（wt%）平均止血时间（s）15070150.552151110250120250.563251112组织静脉出血相对来说容易处理，而动脉出血通常的止血材料基本无能为力。采用载药量为0.5%的15%甘油改性的壳聚糖/羧甲基壳聚糖复合膜处理兔子耳部动脉出血实验表明，在血液与复合膜接触后，膜吸水发生收缩，在没有施加压力情况下，其止血时间为123s。成功止血后，随着时间延长，出血点血液逐步变黑，结痂。abcd图16 不同时间的兔子耳部动脉出血创面，1min（a），2min（b），12h（c），12h（d）综上所述，引入合适比例的甘油可有效地增加复合膜的断裂伸长率约6-8倍；引入合适比例的酚磺乙胺不但可以赋予复合膜快速止血的能力，而且还可通过离子交联作用提供复合膜的拉伸强度。通过对各比例复合膜力学性能的测定可得：甘油的最佳百分比为15%-25%。五、经费使用情况表4 经费支出明细表支出项目用途总
