双环醇对cpgodn诱导的肝损伤的保护作用及机制研究

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1、浙江大学医学院 博士学位论文 双环醇对CpG-ODN诱导的肝损伤的保护作用及机制研究 姓名：娄小娥 申请学位级别：博士 专业：内科学（传染病） 指导教师：陈智 20090401 浙江大学博士学位论文摘要 双环醇对C p G O D N 诱导的肝损伤的 保护作用及机制研究 浙江大学医学院 博士研究生 导师 内科学( 传染病) 娄小娥 陈智教授 中文摘要中又摘要 病毒性肝炎( v i r u sh e p a t i t i s ) 传染性强，发病率高，流行范围广，是全球最主 要的传染病之一。病毒性肝炎肝损伤主要由免疫介导，在肝脏局部，肝细胞受H B V 感染后激活免疫系统，产生炎症与化学趋化因子

2、，将炎症、淋巴细胞活化并募集 至肝脏，这些炎症和淋巴细胞的浸润如果导致过强的免疫反应，则最终引起肝组 织的损伤。因此，调节机体免疫反应和抑制肝脏炎症是乙型肝炎治疗的重要策略 之一。 双环醇( 6 甲氧羰基6 羟甲基2 ，3 ，2 ，3 二亚甲基二氧基4 ，4 二甲氧基联 苯) 由中国医学科学院药物研究所刘耕陶院士和张纯贞教授合作的科研小组历经1 5 年艰辛研制成功，该药降低转氨酶作用显著，对肝细胞具有较好的保护作用，并具 有抗肝纤维化的作用，长期使用无明显不良反应。双环醇的问世为病毒性肝炎的治 疗提供了一种新的安全、有效的辅助治疗药物，其药理基础和作用机制均值得继续 深入研究。迄今为止，已有大

3、量动物实验证明，双环醇对四氯化碳( C C l 4 ) 、D 氨基 半乳糖、对乙酰氨基酚、脂多糖( L P S ) 和刀豆蛋白A ( C o n A ) - 等化学物质诱导的肝 损伤均有保护作用，作用机制涉及抑制氧化和免疫损伤、细胞凋亡和细胞膜稳定等。 但尚缺乏双环醇对病毒感染造成的肝脏炎症的保护作用及其机制的研究。 I I 浙江大学博士学位论文 摘要 近年来关于病原体相关分子模式( P a t h o g e n a s s o c i a t e dm o l e c u l a rp a t t e r n s ， P A M P s ) 的研究进展表明，激活高等动物天然免疫应答的P A

4、 M P s 广泛存在于病原 体细胞表面，识别P A M P s 是以模式识别受体( P a a e mr e c o g n i t i o nr e c e p t o r s ，P P 飚) ， T o l l 样受体( T o l l 1 i k er e c e p t o r s ，T L R s ) 介导的。细菌和病毒的D N A 作为一种P A M P s 能被机体识别并激发免疫应答，是因为其基因组中的一段以非甲基化C p G 二核苷 酸为核心的高保守序列，即C p G 基序( C p Gm o t i f ) 。机体免疫系统通过T L R 9 ( T o l l 1 i k

5、er e c e p t o r9 ) 特异识别细菌和病毒D N A 中的C p G 基序并形成受体复合物 后，通过髓性分化因子8 8 ( m y e l o i dd i f f e r e n t i a t i o nf a c t o r8 8 ，M y D8 8 ) 依赖途径，激活 N F r d 3 ( n u c l e a rf a c t o r K B ) 通路和应激酶通路等信号转导通路，促进机体产生T h l 型细胞应答和分泌炎症因子，当炎症因子过度释放时，则造成宿主的炎症或损伤。 研究证实人工合成的含一个或数个非甲基化C p G 基序的寡聚脱氧核糖核酸( C p G o

6、 l i g o d e o x y n u c l e o t i d e s ，C p G O D N s ) ，也具有和细菌及病毒D N A 中C p G 基序一样的 免疫刺激效应。因此，C p G O D N s 可用以模拟细菌和病毒等微生物病原侵入机体 所引发的免疫反应状态，构建相应的疾病模型。 目前已有研究小组构建了C p G D N A L P S 以及C p G D N A D G a l N 诱导的小鼠 肝损伤模型，为我们进一步研究病毒感染后的肝脏炎症免疫病理提供了可能的模 型。本研究中，我们用C p G O D N D G a I N 造成小鼠肝损伤，模拟小鼠感染D N A

7、 病毒后所引起的肝脏炎症反应，来研究双环醇的保护作用和机制。根据C p G O D N 的免疫活性具有种属特异性的特征，第一部分研究中，我们以对小鼠具有最佳免 疫效果的C p G l 8 2 6 构建小鼠肝损伤模型；第二部分研究中，则以对人类最具免疫 效应的C p G 2 0 0 6 模拟病毒刺激人正常细胞株L 0 2 细胞，从整体动物和离体细胞两 个水平研究双环醇对C p G O D N 造成的免疫性炎症的保护作用，及其对T L R 9 介导 的信号通路分子的活化和细胞因子分泌的作用。 I I I 浙江大学博士学位论文摘要 1 双环醇对C p G o D N | D G a i N 诱导的小

8、鼠肝损伤的保护作用及 其机制 目的：用C p G O D N 诱导D G a I N 致敏的小鼠肝脏炎症，研究双环醇的保护作 用及可能的机制。 方法：B A L B C 小鼠随机分组，每组8 只。第1 至5 天每天一次给小鼠灌胃 3 0 0 m g k g 和1 0 0 m g k g 双环醇或溶剂；第5 天给药后2 小时由尾静脉注射 C p G O D N ( 1 8 2 6 ) 2 0 t g D G a l N 2 0 m g 只，模型组仅在第5 天尾静脉注射 C p G O D N ( 1 8 2 6 ) 2 0 1 t g D G a l N 2 0 m g 只。1 2 小时后处死小

9、鼠并留取标本。光镜观察 肝脏损伤的程度；生物化学法测定血清中A L T ；E L I S A 法测定血清及肝脏组织匀 浆中细胞因子T N F o c ， L 1 8 和I F N v 及趋化因子M C P 1 ，M I P 1 a 和R A N T E S 的水平；免疫组化法检测肝脏中T L R 9 表达；W e s t e r nb l o t 方法测定N F 心及M A P K s 信号途径相关分子，包括p 6 5 ，p 3 8 和E r k l 2 的变化。 结果：模型组小鼠血清A L T 为5 5 7 3 3 6 9 5 1 ( U L ) ，比正常组小鼠A L T 高6 倍；双环醇1

10、 0 0 m g k g 和3 0 0 m g k g 组的舢L T 分别为2 2 7 6 7 5 5 ，5 9 和1 3 8 4 5 2 2 5 2 ( U L ) ，与模型组相比分别降低5 9 1 和7 5 2 ；肝脏组织病理切片结果显示， 双环醇能减少肝脏炎症细胞浸润及肝细胞的溶解性坏死，减轻肝脏的损伤程度； 双环醇1 0 0 m g k g 和3 0 0 m g k g 组血清中的细胞因子T N F - 。【、I L 一1 8 和I F N - Y 的水 平和趋化因子M C P 1 、M I P 10 【和R a n t e s 的水平均显著低于模型组，且具有剂量相 关性。其中血清中T

11、 N F 驭降低3 5 6 和7 2 4 ；I L 1 8 降低2 1 8 0 和4 7 。4 ；I F N - v 降低3 0 9 0 和6 3 3 ，M C P 1 降低3 0 5 和7 2 6 ，M I P 1 a 降低2 8 7 和3 8 2 ， R a n t e s 降低2 5 4 和6 4 5 ，都具有显著差异；同时，双环醇对小鼠肝脏组织中的 细胞因子和趋化因子也有类似的作用；免疫组化结果显示，双环醇处理组小鼠肝 脏内T L R 9 表达明显少于模型组；W e s t e r nb l o t 结果则表明，双环醇组P N F 一心p 6 5 、 p - M A P K - p 3

12、 8 和p - M A P K - E r k l 2 的表达明显低于模型组。 结论：双环醇能够抑制C p G O D N D G a I N 诱导的小鼠肝脏炎症，其主要机制 l V 浙江大学博士学位论文摘要 可能是通过参与小鼠的免疫调节作用，抑制炎症因子T N F Q ，I L 1 8 ，I F N Y 的过 量表达，同时抑制T L R 9 介导的信号通路中的有关分子的活化，通过参与小鼠免疫 调节，从多方面对C p G O D N 诱导的小鼠肝损伤起到保护作用。 2 双环醇对C p G D N A 诱导的L 0 2 细胞T L R 9 表达及炎症、趋 化因子分泌的抑制作用及其分子机制 研究表

13、明，炎症发生时，肝实质细胞也参与了机体的免疫反应，能对炎症信 号作出反应，分泌一些炎症细胞因子和趋化因子，并通过作用于临近的肝细胞， 枯否氏细胞、内皮细胞和浸润到肝脏的白细胞等发起、扩大和改变炎症反应。 C p G O D N 可直接作用于肝实质细胞，上调肝细胞上的粘附分子和共刺激分子，从 而使肝细胞具有了类似于抗原递呈细胞的功能，从而打破了机体的免疫耐受，对 肝脏造成炎症性损伤。因此，本部分研究中，我们以正常人肝细胞株L 0 2 作为研 究对象，研究双环醇对C p G O D N 刺激后的L 0 2 细胞分泌细胞因子、趋化因子及 T L R 9 表达等的影响。 目的：以C p G 2 0 0

14、 6 模拟双链D N A 病毒刺激L 0 2 细胞并观察双环醇对L 0 2 细 胞分泌炎症、趋化因子，以及对细胞内T L R 9 表达的影响，研究双环醇对与炎症作 用相关的分子的调节作用和机制。 方法：用不同浓度双环醇( 0 0 1 ，0 1 ，0 S m M ) - 与L 0 2 细胞温孵2 小时后，加入 浓度为1 0 I t e d r n lC p G - O D N 2 0 0 6 ，继续培养1 8 小时，模型组仅加入1 0 “g r r d C p G O D N 2 0 0 6 。用E L I S A 法测定培养上清中T N F c 【、和I L 1 8 及趋化因子M C P 1

15、， R A N T E S 和M I P 1 & 等水平；W e s t e r nb l o t 法和流式细胞术测定L 0 2 细胞内T L R 9 的表达；W e s t e r nb l o t 法测定细胞内p - N F - r Bp 6 5 、P - p 3 8 M A P K ，p E r k l 2 M A P K 的变化。 结果：双环醇能够剂量依赖性地抑制C p G O D N 诱导的L 0 2 细胞趋化因子的 V 浙江大学博士学位论文 摘要 释放和T N F O 【等细胞因子的分泌，其中双环醇0 5 m M 组和模型组相比，T N F o 【、 I L 18 、M C P 1

16、 、M I P 一1 Q 和R a n t e s 分别降低7 7 9 ，8 8 7 ，7 4 6 ，6 3 3 和6 4 0 。 W e r s t e mb l o t 和流式细胞术结果一致表明，双环醇0 5 m M 和O 。l m M 能够下调L 0 2 细胞内经O D N 诱导表达的T L R 9 ，同时，还能抑制相关N F 1 出通路蛋白p 6 5 和 M A P K 通路相关蛋白p 3 8 及E R K l 2 的磷酸化。 结论：双环醇能明显抑制C p G O D N 诱导的人肝细胞株L 0 2 炎症因子和趋化 因子的释放与分泌，并且抑制L 0 2 细胞内T L R 9 的表达及相关N F r d 3 和M A P K 信号传导途径分子的磷酸化活性。 综上，本课题首次研