《原小檗碱类和共轭亚油酸抗阿尔茨海默氏症的药理作用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《原小檗碱类和共轭亚油酸抗阿尔茨海默氏症的药理作用（59页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、中山大学 硕士学位论文 原小檗碱类和共轭亚油酸抗阿尔茨海默氏症的药理作用 姓名：陈青 申请学位级别：硕士 专业：微生物与生化药学 指导教师：钟翎 20090516 陈青巾山大学硕士学位论文 原小檗碱类和共轭亚油酸抗阿尔茨海默氏 症的药理作用 专业：微生物与生化药学 硕士研究生：陈青 指导教师：钟翎副教授 摘要 阿尔茨海默氏症( A l z h e i m e r Sd i s e a s e ，A D ) 是一种慢性原发、进行性脑变性 疾病，其标志性的病理改变为：前脑基底部胆碱能神经元的退化和丢失；细胞内 高度磷酸化的微管蛋白组成的神经元纤维缠结和以D 淀粉蛋白( p a m y l o i
2、dp e p t i d e ， A D ) 为沉积核心的老年斑。本研究以体外培养S H S Y 5 Y 为研究对象，探讨原小 檗碱类生物碱针对以上病理特征的多靶点作用和共轭亚油酸的抗A D 作用。 一、原小檗碱类多靶点抗A D 药理作用 原小檗碱类生物碱是一类异喹啉类生物碱，它们具有相同的药效基团，广泛 存在于多种属植物体内，其药理作用广泛，其中抗菌、镇痛和降糖作用是临床常 用的药理作用。实验材料：小檗碱、四氢黄藤素、小檗红碱、药根碱和金黄紫堇 碱，均来自岩黄连( C o r y d a l i st h a l i c t r i f o l i aF r a n c h ) 的提取物。本
3、研究检测了上述 五种生物碱的多靶点抗A D 效应及分子作用机制。利用R T P C R 、W e s t e r nb l o t 、 E L I S A 等实验技术，检测了它们对体外培养S H S Y 5 Y 细胞中淀粉样前体蛋白 A P P ) 、p 分泌酶( B A C E I ) 、胞外可溶性淀粉样前体蛋白( s A P P a ) 以及乙酰胆碱酯 酶( A C H E ) 活性的影响。结果显示，各化合物处理2 4h 后，除了金黄紫堇碱外， 其他四种化合物均能显著的抑制B A C E l 蛋白的表达( P 0 0 5 ，n = 6 ，V Sc o n t r o l F i g2 -
4、1 C e l lv i a b i l i t yo fS H - S Y 5 Yt r e a t e dw i t hJ a t B e r u , T H P , B e ra n dS c o ( 0 - - 。8 0g M ) f o r4 8h P 0 0 5 ，n = 6 ，V Sc o n t r o l 3 2 原小檗碱类可显著抑制B A C E I 蛋白表达 B A C E l 即p 分泌酶是A p 产生的限速酶，抑制p 分泌酶即可阻止或减少A p 的产 生，因而成为预防或治疗A D 的靶点 6 8 , 6 9 】。我们通过W e s t e r nb l o t 检测了
5、1 0g M 的 B e r 、T H P 、B e r u 、J a t 、S c o 对B A C E l 的影响。单体化合物作用细胞1 2h ，2 4h ， 3 6h 后，结果显示：1 0 l M 的B e r 、T H P 、B e r u 、J a t ( 图2 2 ) 在2 4 h 时，明显地降低 了B A C E l 蛋白的表达( P 00 5 ，r e = 6 tV S c o n t r o l 3 2C L A 对A P P 的表达水平没有显著影响 为了考察C L A 对A P P 表达的影响，我们分别在转录水平和蛋白质表达水平两 个方面进行榆测。 采用半定量R T - R
6、 C R 方法，检测了A P P m R N A 的转录水平。用0 8 0 州C L A 处理S H S Y S Y 细胞4 8 d x 时后，可见A P Pm R N A 转录水平未发生明显变化( 图3 2 A ， P 0 0 5 ，n - 3 ) 。 采用W e s t e r n B l o t 方法分析A P P 蛋白质表达水平的变化。结果显示( 图3 2 B ， P 00 5 ，n - 3 ) ，在o - 8 0 州c L A 范围内，A P P 蛋白质的表达未见明显变化。与 R T - R C R 的结果一致，表明C L A 对A P P 无论是在转录水甲还是蛋白质表达水平均 未产
7、生影响。 A 国 L n _ M 0 【J j 】- 】u f “ 【) f l I _ _4 【、u ”r 圈墨墨墨一獭一- 谚髓黼 一置置置置田 一- 囊黑嘲一 目3 - 2A 、R T - P C R 技术检测C L A 对s H S Y S Y 细胞( 4 8 h ) 中A P P 的m R N A 转录水平的影 蚰抽蚰如。 口gu苫#一扫若丑_暑芎u 陈青一I m 大学颂十学位也 响。p - 0 0 5 n = 3 一c o n t r o l B 、W e s t e r n B l o t 技术检测C L A 对S H S Y 5 Y 细胞( 4 8 h ) 中A P P 的蛋白
8、质表达水平的影响。 P 00 5 ，n - 3 ，”c o n t r o l F i g3 - 2 A 、A P Pm R N Al e v e lo fi nS H S Y 5 Yc e l l st r e a t e dw i t hC L Af o r4 8 hb yR T - P C R P O0 5 ，a - 3 I t sc o n t r o l B 、A P P p r o t e i n l e v e lo f i n S H - S Y 5 Yc e i l s t r e a t e d w i t h C L A f o r 4 8 hb y W e s t e
9、r nb l o tP 00 5 ，n = 3 ， v sc o n t r o l 3 3C L A 可抑制B A C E I 蛋白质表达 B A C E l 即1 3 分泌酶，是A B 的限速酶，减少或降低其表达或活性，有助于 控制A B 的产生。I 。我们采用W e s t e r n B l o t 疗法检测了B A C E l 蛋白质表达水甲。 结果表明，随着C L A 浓度的增加，B A C E I 蛋白质的表达逐渐减少，在4 0 和6 0 g M 时达到最低，但在9 0p M 时又有所升高( 图3 - 3 ，+ P 00 5 ，n - 3 V Sc o n t r o l F i
10、 g 3 - 5 A 、P P AR ym R N Al e v e lo f i nS H - S Y 5 Yc e l l st r e a t e dw i t hC L Ab yR T - P C R ( 4 8 h ) P 00 5 ，n = 3 ，v Sc o n t r o l B 、P P A R rp r o t e i n l e v e lo f i nS HS Y 5 Yc e i l s t r e a t e d w i t h C L A b y W e s t e mb l o t ( 4 8 h ) P 0 0 5 ， n - 3 V Sn t r o l 3
11、 5 2 P P A R 7 介导C L A 对A P P 水解途径的作用 我们以前利用P P A R T 抑制剂显示了C L A 对P P A 脚的激活作用1 7 7 , 7 8 】，本研 究利用s i R N A 技术进一步证实了这结果。实验表明偿j3 - 6 1C L A 可明显提高 s H - S Y 5 Y 细胞中P P A R 7 的表达，足对照的12 倍f + P 00 1 ，n - 3 ) 。用电穿孔 法将P P A R 7 s i R N A 转入细胞之后，与对照相比，P P A R y 的表达降低了近3 0 ( + P 00 5 ，n - 3 ) ，当6 0 ”M 的C L
12、 A 与P P A R T s i R N A 共处理一S H S Y 5 Y 细胞时， 未见到P P A R y 有明显变化，其表达水甲与末加C L A 时基本致，说明 s i R N A - P P A R 7 抑制了C L A 对P P A 褂的馓活作用，即C L A 对S H S Y 5 Y 细胞r f l P P A R y 的具有激活作用，C L A 可能作为核受体P P A R y 的配体，激活其调节的下 游靶基因。 为了考察P P A R 7 是否介导c L A 对细胞中B A C E l 和s A P P c x 的影响，在上述结果 的基础上，我们分别考察T B A C E
13、I 和胞# I , s A P P t t 的分泌。当用P P A R ys i R N A 处理 细胞时，与对照相比，B A C E I 的表达可见明显升高( + P 0 0 5 ) ( 图3 6 B ) ：同样条件下，p P A R 7 一s i R N A 可使胞外s A P P n 分泌有所降 低而用6 0 “M 的c L A 与P 队脚一s i R N A 共处理时，s A V P a 有所升高，但只比c L A 单独存在时减少了3 0 ( P 0 0 5 ，P 0 0 1 ) ( 图3 6 c ) 。 A _ o 、H 一： | ；l II I 亓而| | ：- 、 幽3 - 6
14、A 、C L A 对s i R N A P P R A y - S HS Y 5 Y 细胞中P P A R y 蚩白质水平的影响( 6 0 M C L A ， 4 8 1 1 ) ( + ， o0 5 十+ P ( 00 l ，n = 3 ，v sc o n t r 0 1 ) B 、C L A 对s i R N A p p R A y - S H S Y 5 Y 细胞B A C E l 量白质水平的影响。( 6 0p MC L A ，4 8 m ( + P 00 5 ，n - 3 ，v sc o n t r 0 1 ) C 、C L A 对s i R N A P P R A y - S H
15、S Y 5 Y 细胞胞外s A P P n 的蛋白质表达水平的影响( 6 0 “M C L A ， 4 S m ( + P 铷0 5 ，十+ P 00 1 ，f F 3 ，v sc o n t r 0 1 ) F i g3 - 6 A 、P P A R Yp r o t e i n l e v e lo f i ns i R N A - P P R A T - S H - S Y 5 Y c e l I s t r c a l c d w i t h C L Ab y W e s t e m b l o t ( 4 8 h ) ( + P 00 5 P 00 1 ；n - 3 ；v sc o
16、n t r 0 1 ) B 、B A C E Ip r o t e i nl e v e lo fi ns i R N A - P P R A V S H S Y 5 Yc e l l st r e a t e dw i t hC L Af o r4 8 hb y W e s t e r nb l o t ( + P O O l ；n = 3 ；v sc o n t r 0 1 ) C 、s A P P a 盟c r c t i o nl e v e rf r o ms i R N A P P R A 7 - S H - S Y 5 Yc e l l st r e a t e dw i t hC L Af o r4 8hb y E L I S Aa s s a y ( + P 00 5 + P 0 0 l ；n - 3 ；v sc o n t r 0 1 ) 4 讨论 细胞、动物模型及I 临床
