北极狐gh、ghr、igf1和igf1r基因的cdna克隆、表达及相关性状的研究

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1、东北农业大学 博士学位论文 北极狐GH、GHR、IGF1和IGF1R基因的cDNA克隆、表达及相关性 状的研究 姓名：杜智恒 申请学位级别：博士 专业：动物遗传育种与繁殖 指导教师：白秀娟 20080620 摘要 |I I 摘要 本研究以哺乳动物G H 、G H R 、I G F I 和I G F l R 基因序列为基础，通过比较基因组学和生 物信息学等方法克隆了北极狐的G H 、G H R 、I G F l 和I G F l R 基因e D N A 序列；采用R e a lt i m eP C R 方法分析了G H 、G H R 、I G F l 和I G F l R 基因的时空表达规律。以

2、大兴安岭图强林业局狐场北 极狐群体为研究材料，采用测序和P C R - S S C P 的方法检测了北极狐G H 、G H R 、I G F l 和I G F l R 基因的多态性，并进行了基因多态性与生长性状的相关分析。主要研究结果如下： 1 克隆了北极狐G H 基因的e D N A 序列，片段长度7 1 8 b p ，并已发布到G e n B a n k 中 ( A c c e s s s i o nN o E U l 5 9 5 8 4 ) ；克隆了G H 基因的内含子，将其与该基因的e D N A 序列拼接， 片段长度1 6 9 2 b p ，并已发布到G e n B a n k 中(

3、 A c c e s s s i o n N o E U 3 7 6 0 4 5 ) 。 2 克隆了北极狐G H R 、I G F l 和I G F I R 基因的c D N A 序列，片段长度分别为2 0 0 6 b p 、 1 7 1 7 b p 和2 4 1 l b p ，并已发布到G e n B a n k 中，序列号分别为( A c c e s s s i o nN o E U 3 0 4 3 2 5 ) 、 ( A c c e s s s i o nN o E U 3 0 1 6 0 9 ) 和( A c c e s s s i o nN o E U l 5 9 5 8 2 ) 。

4、 3 R e a lt i m eP C R 分析表明北极狐G H 基因在6 月龄检测的各种组织中仅在垂体组织中 表达；各时期( 2 、4 和6 月龄) 该基因在垂体组织中的表达结果表明，该基因在2 月龄垂 体组织中表达量最低，在6 月龄表达量最高。 4 R e a lt i m eP C R 分析表明北极狐G H R 基因在6 月龄检测的各种组织中，在肝脏、肺、 胰腺、大脑、垂体、十二指肠、睾丸、心脏、肌肉组织中均有表达；各时期( 2 、4 和6 月 龄) 该基因在肝脏和肌肉组织中的表达结果表明，G H R 基因在这两个组织中表达量均呈递 增趋势。 5 R e a lt i m eP C R

5、 分析表明北极狐I G F I 基因在6 月龄检测的各种组织中，在肝脏、脾脏、 肾脏、肺、胃、胰腺、大脑、垂体、睾丸、心脏、肌肉组织中均有表达；各时期( 2 、4 和6 月龄) 该基因在肝脏和肌肉组织中的表达结果表明，1 G F l 基因在这两个组织中表达量均呈 递增趋势。 6 R e a lt i m eP C R 分析表明北极狐I G F l R 基因在6 月龄检测的各种组织中，。在肝脏、脾 脏、肾脏、肺、胃、胰腺、大脑、垂体、睾丸、心脏、肌肉组织中均有表达。各时期( 2 、4 和6 月龄) 该基因在肝脏、睾丸和肌肉组织中的表达结果表明，I G F l R 基因在肝脏组织中表 达量呈递增趋

6、势；在睾丸组织中6 月龄表达量最高，4 月龄表达量最低；在肌肉组织中4 月 龄表达量最高，2 月龄表达量最低。 7 在北极狐G H 基因的外显子2 、内含子2 和外显子3 上发现四个多态位点，分别为外 显子2 上的G S I A 突变、内含子2 上的C 1 8 6 T 和T 2 3 9 C 突变，以及外显子3 上的C 5 8 3 A 突 变；G H 基因C 5 8 3 A 多态性与公狐的体长性状显著相关( P I G F 2 ，表明I G F I 与G H 在长期 促生长效应上具有协同作用。基于此，本研究以生长激素( G H ) 基因、生长激素受体( G 腿) 基因、胰岛素样生长因子I ( I

7、 G F I ) 基因和胰岛素样生长因子I 受体( I G F l R ) 基因为候选 基因，参照哺乳动物的研究结果，对狐的G H 、G H R 、I G F I 和I G F I R 基因的c D N A 序列进 行克隆和基因时空表达规律研究，并对上述基因编码的氨基酸序列与其它动物的氨基酸序列 进行分子系统进化数分析，同时结合数量遗传学和生物统计学分析这些基因的变异对狐生长 性状的影响，探讨这些基因是否为影响狐狸生长性状的主效基因并且能否作为分子标记用于 标记辅助选择。 1 2 文献综述 1 2 1Q T L 的检测方法 对数量性状位点( Q u a n t i t a t i v et r

8、 a i tl o c i ，Q T L ) 的检测和利用是实现从分子水平上对控制 畜禽重要经济性状的基因进行操纵的关键。因此这方面的研究成为分子数量遗传学的核心内 容，也是目前国内外动物遗传育种领域的研究热点，各国都在投入巨资抢占这一制高点。总 体来看，对Q T L 的检测有两种最基本的策略，一是候选基因法( C a n d i d a t eg e n ea p p r o a c h ) ， 另一是基因组扫描法( G e n o m es c a n n i n ga p p r o a c h ) 。 1 2 1 1 候选基因法 分子遗传学及测定技术的飞速发展，对畜禽基因组分析的深入研

9、究起了有力的推动作 用。通过基因组分析可以从核酸水平上来认识遗传物质，鉴定基因功能单元及摸清其作用机 理，并确定控制表型性状的基因或与该基因紧密连锁的遗传标记，在此基础上可对畜禽直接 进行基因型选择或标记辅助选择。然而，基因组分析有多种方法，其中候选基因法( c a n d i d a t e g e n e s ) 和连锁分析法( 1 i n k a g em a p p i n g ) 是鉴定数量性状基因位点的二种基本方法，它们分 别用候选基因或遗传标记与表型性状进行连锁分析来鉴定或定位数量性状基因位点。但是， 连锁分析法需要建立参考家系，耗资巨大；而候选基因法具有统计功效强、应用广、费用

10、低 和操作简单等优点，使得该方法的研究较基因组扫描法( G e n o m es c a n n i n ga p p r o a c h ) 活跃 3 东北农业大学农学博+ 学位论文 得多，成为目前在动植物育种中检测重要经济性状Q T L 的有效方法( R o t h s c h i l da n dS o l l e r ， 1 9 9 7 ) 。 候选基因法首先是根据已有的生理生化知识对复杂数量性状进行剖析，推断哪些基因可 能参与了性状的形成；然后选定一些基因( 称为候选基因) ，通过分子生物学实验检测这些 基因及其分子标记对特定数量性状的效应，筛选出对数量性状有显著影响的基因和分子标

11、记，并估计出它们对数量性状的效应值；最后在实践中证实基因的变异能否带来性状真实的 表型变异。候选基因法费用低，操作简单，便于在标记辅助选择( M A S ) 中应用。 候选基因法主要包括以下几个步骤：l 选择合适的候选基因；2 揭示候选基因序列的多 态性；3 选择合适的检测基因型的方法；4 确定用于候选基因分析的群体：5 基因型与表型 性状间的相关分析；6 标记基因与Q T L 连锁关系的验证。 1 2 1 2 基因组扫描法 基因组扫描，也称为标记- Q T L 连锁分析( M a k e r - Q T Ll i n k a g ea n a l y s i s ) ，是基于遗传标 记座位等

12、位基因与Q T L 等位基因之间的连锁不平衡关系，通过对遗传标记从亲代到子代遗 传过程的追踪以及它们在群体中的分离和数量性状表现之间的关系的分析，来判断是否有 Q T L 存在、它们在染色体上的相对位置以及它们的效应大小，因而这类方法的前提是：1 要 有理想的遗传标记；2 要有合适的群体，在该群体存在分离的Q T L 。Q T L 一连锁分析的优点 主要为成功率高，理论上可以检测出基因组中的所有Q T L ；缺点为成本高、耗时长，统计 分析难度较大，很难精确定位和不便应用等。 基因组扫描法的基本步骤包括：1 进行试验设计；2 选择遗传标记；3 收集数据；4 构 建标记连锁图谱；5Q T L 的

13、检测及Q T L 参数估计。 这两种方法各有优缺点。候选基因法采取的是“重点突破”的战略，但在众多的基因中我 们到底要针对哪些基因去研究是解决问题的关键。候选基因法尽管操作简单，但容易遗漏那 些基于我们目前的知识不知道其功能但可能对我们所关注的目标性状有很大影响的基因。因 此，利用候选基因法进行Q T L 检测的关键是选择候选基因。基因组扫描法采取的是“全面出 击”的战略，但进行全面的基因组扫描必须有较大的先期投入( 如建立资源群体、大量的微 卫星标记) ；另外，对于用这种方法检测到的Q T L ，研究者必须阐明这些Q T L s 中到底包含 哪些基因，只有这样才能对Q T L 进行有效的操作

14、。因此，最理想的检测办法就是将两者有 机的结合起来，既避免“挂一漏万”，又做到“有的放矢”。 1 2 2 候选基因的S N P s 检测方法 单核苷酸多态性( S i n g l e N u c l e o t i d eP o l y m o r p h i s m s ，S N P s ) 被称为第三代D N A 标记。 S N P s 是指染色体基因组水平上单个核菅酸变异引起的D N A 序列多态性，在人群中的发生 频率大于1 。S N P s 有单碱基的转换、颠换、插入缺失等形式。转换与颠换比例约为2 ：1 。 在基因编码区( 人) 估计有2 0 0 0 0 0 个S N P ，称为c

15、 S N P s ( C o d i n gR e g i o n sS N P s ) ，与蛋白质 功能有关。S N P s 包含了已知多态性的8 0 ，是最常见的遗传变异类型。 S N P s 作为一类遗传标记有以下几个主要特性：1 密度高。在人类基因组，估计平均每 1 0 0 0 b p 就有一个S N P ，在整个基因组大约有3 1 0 6 个，遗传距离为2 - 3 c M 。其密度比微卫星 标记更高，可以在任何一个待研究基因的内部或附近提供一系列标记；2 代表性。某些位于 4 前言 基因内部的S h i P s 有可能直接影响蛋白质结构或表达水平，因此它们可能代表疾病遗传机理 中的某

16、些作用因素；3 遗传稳定性。与微卫星等重复序列多态标记相比，S N P s 具有更高的 遗传稳定性；4 易实现自动化分析。S N P s 只有两个等位基因，又称双等位基因标记，在检 测时能通过一个简单的+ ”分析进行基因分型，而无需象检测R F L P 及微卫星多态标记那样 进行片段长度的测量。随着仪器设备的进步，使得S N P s 的检测、分析方法呈现出高通量、 自动化的特点。简介三种常用的阶o s 的检测方法如下。 1 2 2 1 直接测序 在已有的各类方法中，测序是检测突变最准确、最彻底的方法。通过直接测序检测S N P s 的原理是：通过对不同个体同一基因或基因片段进行测序及序列比较，寻找所研究的D N A 片段中存在的所有碱基变异。采用直接测序检测S N P s 还可以同时得到S N P s 的类型、在所 研究片段中的准确位置、S N P s 分型及应用所需要的重要参数等，但其缺点是目前的测序比 较费时、费力，成本较高。 1 2 2 2P C R S S C P 技术 早在1 9 8 0 年M a x