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1、,食用菌生物学实验 张志瑾,实验一母种培养基配制及棉塞制作,一.实验目的 1、 掌握食用菌固化培养基的配制。 2、学会棉塞 的制作方法。 二、基本原理 食用菌母种分离、移接和斜面保存菌种都必须要制作相应的培养基,以备食用菌的培养、分离和保存之用。 培养基是根据各种食用菌在生长繁殖过程中对营养物质需求制成的,它可供给食用菌的C源、N源、水分、各种无机盐及生长物质等。 培养基的种类很多,本实验学习斜面培养基(PDA)制作。,三.实验准备 1.器具: 天平、称量纸、牛角匙、精密pH试纸、量筒、刻度搪瓷杯、试管、三角瓶、漏斗、漏斗架、玻璃棒、烧杯、试管架、铁丝筐、剪刀、棉花、线绳、牛皮纸、皮筋、纱布、
2、电炉、菜刀、菜板、小铝锅等。 2材料: 马铃薯、葡萄糖或蔗糖、琼脂、水。 四、实验内容 过程:制马铃薯滤液融化琼脂培养基的分装 棉塞的制作 方法步骤:,1配方(PDA):马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂1520g,自来水1000ml,pH自然。 2制作方法 (1)制滤液: 马铃薯刮去粗皮,去芽眼,切成碎块,称量后放锅中,加水12001300ml,将其煮沸20min。用双层纱布过滤,取1000ml滤液。,(2)化琼脂: 将滤液加热至将沸腾时加入琼脂,不断搅拌,注意控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待琼脂完全融化后加入剩余原料,并使其溶解(用热水补足水量).,(3分装 :通过漏斗装置,趁热将培养基
3、分装于试管中,装量约占试管高度的1/4(分装三角瓶,其,装量以不超过其容积的一半为宜)。注意管口或瓶口不要沾染培养基。 (4)制棉塞 棉花以白色长绒脱脂棉为宜。根据试管口大小取棉,将其卷成棉塞,最好 外包一层纱布。将棉塞塞入试管口。棉塞塞入试管2/3。制做棉塞要求外表光滑,外包的纱不能折、松紧适宜等。,A.正确; B.不正确,(5) 包扎: 管口堵入棉塞后7或9支试管扎一捆,棉塞部分用牛皮纸包扎。在包装纸上标明培养基名称,制备组别和姓名、日期等。 (6)、灭菌 (7)、摆斜面 (8)、存放冰箱(4-6C) 六、作业 1、简述高压灭菌锅的使用。 2、何谓灭菌?简述热力灭菌的类型和原理。 3.何时
4、加入琼脂?融化时注意什么问题?分装的技术要求有哪些? 4. 棉塞的作用有哪些和技术要求?菌种培养时管口堵胶塞或软木塞行吗?为什么?,实验二、食用菌接种环境的消毒、灭菌与斜面接种 一.目的及要求: 1.掌握食用菌斜面接种方法及无菌操作技术。 2、能正确分析自己的接种效果。 二、基本原理:食用菌斜面接种是食用菌栽培过程中最基本的方法之一,也是食用菌制种工作最重要的一个环节。因为在食用菌栽培过程中,一旦斜面接种污染,后面的工作将无法进行,故斜面菌种的接种、分离和移接非常重要,必须在严格无菌操作条件下进行,才能获得纯菌丝体(纯菌)。,三、实验准备 1.材料:空白斜面培养基(无菌检验 )、母种等 2.器
5、具:酒精灯、接种环、火柴、尖头镊、酒精棉球、大镊子、接种箱、超净工作台、高锰酸钾、37甲醛溶液、紫外灯、2%来苏水、标签纸等。 四、实验内容 1、 接种环境的处理 2、母种的转管技术,五、方法步骤 1.接种环境的处理 (1)接种箱的熏蒸: 先用2%来苏清洁接种箱内外,放入接种所需的物品,用甲醛熏蒸。每立方米空 间 一般用甲醛10ml,加半量高锰酸钾(57g)使甲醛氧化挥发。先将高锰酸钾放入接种箱内的容器中,再注入甲醛,立即产生强烈刺激的甲醛气体。熏蒸25-30min。,(2)超净工作台的消毒:用消毒液擦拭台面后放置接种所需物品,开启超净工作台上的紫外灯,照射20-30分后使用。 2.母种的转管
6、技术 (1)手及菌种管的消毒:用肥皂洗手,再用75酒精棉球擦手和菌种管表面,在酒精灯焰上略烧试 管 外的棉塞后,立即将菌种管放入接种箱内。 (2)转管:两手从接种孔伸人接种箱内,酒精棉球擦拭接种环。左手持菌种管和斜面管,两支试管口对齐于火焰上方。右手持接种环或针和铲等,并将其在灯焰上干热灭菌,用小指及无名指拔掉棉塞,接种环冷却后伸入菌种管内取略豆粒大菌种块,迅速移人斜面培养基的中部。然后将棉塞在火焰上烧一下,立即塞入试管口,旋紧棉塞。接种环不要触碰管口及管壁。接种后的试管应立即贴标签,注明菌种名称及接种日期,再进行适温培养。,母 种 转 管 过 程,六、作业 1、何谓无菌操作、消毒?消毒分哪几
7、种类型? 2、同学相互评比接种结果 分析自己接种成败的原因。,实验三、食用菌母种制作分离技术 一、目的要求 1、明确食用菌无菌操作技术要点。 2、掌握食用 菌母种分离技术。 二、基本原理:食用菌母种分离方法较多,但主要采用组织和孢子分离,所不同的是前者取子实体某块组织,后者取子实体的孢子经过培养形成的纯菌丝体(纯种)。 三、实验准备 1.材料:空白斜面培养基(空白培养无菌).食用菌子实体等 2.器具: 酒精灯、接种环、火柴、尖头镊、酒精棉球、大镊子、接种箱、超净工作台、高锰酸钾 37甲醛溶液、紫外灯、2%来苏水、标签纸等。,四、实验内容 1、 组织分离 2、 孢子分离 五、方法步骤 1.接种环
8、境的处理 (1)接种箱的熏蒸 先用2%来苏清洁接种箱内外,放入接种所需的物品,用甲醛熏蒸。每立方米空间一般用甲醛10ml,加入高锰酸钾(57g)使甲醛氧化挥发。先将高锰酸钾放入接种箱内的容器中,再注入甲醛,立即产生强烈刺激的甲醛气体。熏蒸20-30min。,(2)超净工作台的消毒 用消毒液擦拭台面后放置接种所需物品,开启超净工作台上的紫外灯,照射20-30min后使用。 接入的母种 2.组织分离法 此法是生产中最常用的方法,具有操作简便,菌丝萌发快,分离所得的菌种在培养基条件适宜的情况下,能保持原菌种的优良性状。,(1)种菇消毒 在接种箱内,用镊子夹着燃烧的酒精棉球迅速擦拭菇体。 (2)取接组
9、织将菇体撕开,用无菌尖头镊在柄盖交界处取绿豆粒大组织,放入斜面培养基中央,迅速塞上棉塞。 3.多孢子分离 (1)钩悬法是一种特别适用于耳类,也适用于伞菌类的多孢分离法。 在接种箱内将一小块消毒的耳片或菇片悬挂于无菌三角瓶内(装约1cm厚的培养基),在25左右条件下,约24h现孢子粉时以无菌操作法取出分离材料。适温培养后挑取健壮尖端菌丝转管。,(2)孢子印分离法 取成熟子实体经表面消毒后,切去菌柄,将菌褶向下放置于灭过菌的有色纸上,在2024静置一天,大量孢子落下形成孢子印,接种环沾少量孢子在试管或平板培养基上划线培养。,4.母种的培养 将斜面朝下斜置叠放于瓷盘中,放于培养箱中适温培养。23天后
10、每天都要检查菌丝生长情况。及时挑拣污染试管(出现粘膜或杂色)。 5.注意事项:分离的母种一定纯化后再做出菇试验。 (1)纯化菌丝长至斜面1/2时,挑尖丝转管,培养成再生母种。 (2)出菇试验将再生母种扩成原种、栽培种,使其出菇。看产量、质量、形态、长势、抗性如何,经 鉴定为优质菌种后,才可供生产使用。 (3)控制菌龄菌丝 即将长满斜面(一般710天)终止培养。分别用于菌种保藏或繁衍原种。,六、作业 1、食用菌菌种分离技术有哪些方法?生产上最常用的是哪一种? 2、.孢子分离的母种为何一定要做出菇试验? 3.试设计一个分离野生平菇菌种的实验方案,实验四 . 食用菌原种栽培种培养基(料) 的 配 制
11、 与 消 毒 灭 菌 一、目的要求 1、掌握原种、栽培种培养基(料)的类 型。 2、学会原种、栽培种培养基(料)的配制方法。 二、基本原理,食用菌原种及栽培种培养基的种类很多,根据主料不同分为粮食颗粒、棉子壳、稻草、玉米芯、粪草、木削等多种。原种、栽培种培养基(料)的配制基本相同,所不同的是原种培养基更精细,营养更丰富、更全面,更易被菌丝吸收;栽培种培养基更粗放,更广泛,更接近生产实际。 原种、栽培种两菌种的生产过程基本相同,主要区别在于接种时取接的菌种不一样。,三、实验准备 1. 材料: 棉籽壳、麸皮、蔗糖、石灰粉、过磷酸钙等。 2器具; 棉塞、打孔棒、菌种袋或瓶、标签、高压灭菌锅、接种箱、
12、消毒药品、线绳等。 四、实验内容 1、培养料的配制 2、 菌种瓶及菌种袋的 分装,五、方法步骤 (一)培养基的配制 (1)配方与配制 P102 粮食颗粒培养基(麦粒、玉米粒等) 配方:粮食粒98.5%,石膏粉1%,碳酸钙0.5%。 配制:将洗净的粮食粒洗净,用1%石灰水泡胀,文火煮沸1520min(熟而不烂,勿 破皮), 捞出晾至无明水后拌入余料。原种多使用颗粒培养基。,棉籽壳麦麸培养基 配方:棉籽壳87%,麦麸10%,白糖1%,石灰1%,过磷酸钙1%。 配制:将棉籽壳、麦麸、石灰混合为主料,余料溶解于少量水后浇入主料中。边加清水边翻拌至含水量达60%65%(紧握料的指缝中有水泌出而不下滴)。
13、,(2)分装:原种培养基装入菌种瓶(或其他大口瓶),装量约占瓶高的1/2(非颗粒培养基可装至瓶肩,用锥形棒打一料孔),瓶口擦净,堵棉塞后外包牛皮纸或双层报纸。 栽培种培养基一般装入聚丙烯菌种袋,上端套颈圈后如同瓶口包扎法。两端开口的菌种袋可将两端扎活结。装料要求外紧内松,培养料需紧贴瓶壁或袋壁。松散的培养料会导致菌丝断裂及影响对养分、水分的吸收。,(二)培养基的灭菌 原种与栽培种培养基的容器大、装量多,应增加灭菌压力及灭菌时间。高压蒸汽灭菌,一般在压力(1.5kg/cm2)、温度约128.1条件下,保持灭菌时间12h。若采用常压灭菌,需保持最高温度10h左右, 再闷1天或1晚。 六、作业(料)
14、的配置有何不同?粮食颗粒为何要进行泡和煮?,实验五、食用菌原种、栽培种接种环境消毒、灭菌与接种 一、目的要求 1、掌握接种前的准备工作及原种、栽培种的接种。 2、能通过培养观察分析自己的接种结果和存在的问题。 二、基本原理 食用菌菌种制作分为三个阶段,即:母钟、原种、栽培种;栽培种是对菌种的再次扩大培养,为食用菌生产提供大量优质菌种,是生产的需求。同时,也使菌种适应大生产用的栽培料和生态环境的需求,通过菌种的多次扩繁提纯以逐级检查菌种的品质,及时存优去劣,以获得高产优质菌种。,三、实验准备 材料器具: 一、二级菌种、接种耙铲、大镊子、酒精灯、火柴、酒精棉球、标签、高压灭菌锅、接种箱、消毒药品等
15、。 四、方法步骤 食用菌一二级菌种的生产过程基本相同,主要区别在于接种时取接的菌种不一样。 (一)接种转管(瓶) 灭菌后的原种及栽培种培养基及时运送至无菌环境中,待料温降至约24,进行抢温接种。,(1)接原种 用接种耙铲取蚕豆大母种(连同培养基)放于瓶中培养料的孔口处用料盖实(一般1支母种可接10支再生试管母钟;一只再生试管母钟约接58瓶原种),(2)接栽培种 用大镊子、接种铲或接种匙取枣大原种,放于瓶或袋中料面上(若两端扎活结的菌种袋,每端都要接入原种)。1瓶原种约接60瓶或25-30袋栽培种。去弃表面老化菌丝及老种块。堵棉塞或用线绳扎袋口。贴标签,注明菌种名称和接种日期。,(二)培养 接种
16、后将种瓶(袋)置于适温下培养。菌种瓶初放时,应直立于床架上,当菌丝吃料后,再将其横放;菌种袋根据气温可单层或多层叠放,隔45天转动或调换位置,以利于受温一致,并避免培养料水分的沉积;经常检查及时去除出现杂色、粘液及菌种死亡的瓶或袋; 逐渐降温当菌丝长至料深的1/2时,降温23,以免料温升高,菌丝生长细弱;注意菌龄原种约30天、栽培种约2030天菌丝长满,再继续培养710天是使用的最好菌龄。,五、作业 1、原种和栽培种培养基(料)的配置有何 不同? 2、何谓接种?一只试管种可接多少瓶原种和栽培种? 3、菌种的表面有一块残留的琼脂块,证明该菌种是哪级菌种?菌种表面有少许玉米粒或麦粒,证明该菌种是哪级菌种?菌种在适宜条件下培养了十多天,发现有些菌种块丝毫未萌动,请分析原因?,实验六、食用菌制种及栽培中主要病虫害识别综 合观察分析(综合) 一、目的要求 能正确识别主要病虫害的形态特征及侵染症状,分析