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1、浙江理工大学本科毕业论文外文翻译 黄瓜花叶病毒编码2b的基因抑制拟南芥Argonaute1裂解活性来抵抗植物的防御原文出处： Zhang X, Yuan YR, Pei Y, et al. Cucumber mosaic virus-encoded 2b suppressor inhibits Arabidopsis Argonaute1 cleavage activity to counter plant defenseJ. Genes Dev. 2006 20: 3255-3268黄瓜花叶病毒编码2b的基因抑制拟南芥Argonaute1裂解活性来抵抗植物的防御RNA沉默是指RNA调控介导的
2、微流程，抑制内源基因的表达，从而抵抗宿主病毒的侵害。病毒编码抑制器作为一种抗宿主防御机制，可以阻止RNA沉默。黄瓜花叶病毒（CMV）编码的2B蛋白是最先的抑制器，决定着抑制转录后基因沉默（PTGS），但很少或几乎不影响miRNA的功能。底层2b中抑制RNA沉默的机制是未知的。在这里，我们证明CMV2B蛋白也能干扰miRNA的途径，引出发展异常部分表型模型AGO1突变的等位基因。对比大多数抑制器的特征，2b与Argonaute1（AGO1）能在体外和体内直接相互作用，并且这种相互作用主要发生在AGO1表面的一个含PAZ的模块和PIWIbox的一部分。与此相一致的作用还有在RISC重建试验中2B极
3、大的抑制了AGO1裂解活性。此外，AGO1新病毒干扰RNA（siRNA）来源于体内，这表明AGO1是防御CMV感染的主要因素。我们的结论是2B的AGO1活性通过抑制miRNA的途径，削弱RNA沉默，抵抗宿主防御。这些发现从分子角度了解了宿主RNA沉默抗病毒的和病毒的自我反抗机制。关键词：病毒抑制;黄瓜花叶病毒2b蛋白; RNA沉默; AtAGO1;裂解活性; 反防御RNA沉默是指RNA介导的抑制基因表达的过程。多种途径影响RNA沉默，但他们都有某些核新的生化特点。RNA沉默启动通过RNA酶III型的Dicer酶与双链RNA（dsRNA）或不完全自我折叠发夹前体成小干扰RNA（siRNA）或mi
4、RNA双链体。小RNA双链是之后掺入核糖核蛋白复合称为RNA诱导的沉默复合物（RISC），能降解互补的小RNA的任何RNA（巴特尔2004年;泊和赛摩2005）。RISC复合物的核心组件是一个Argonaute（AGO）蛋白质，它具有PAZ结构域，提供了一个32核苷酸伸出来的口袋和PIWI域并赋予核酸内切酶活性（霍尔2005;宋Joshua-2006年TOR）。在拟南芥中，AGO蛋白家族包含10个假定的部件（Fagard等人，2000），其中AGO1是最好的表征。参与AGO1中RNA沉默最初由遗传分析揭露，因为强大的AGO1等位基因表现出严重miRNA积累缺陷，靶mRNA切割，和产生的发育异常
5、（Vaucheret等人。2004年）。此外，AGO1突变体自发受损转基因的沉默（Fagard等人，2000），并过敏到黄瓜花叶病毒（CMV）（莫瑞尔等，2002）。AGO1的生物学作用在RNA沉默中通过最近的两项生化研究被证明，同时证明AGO1裂解活性是在体外（鲍姆贝格尔2005年Baulcombe;齐等人。2005年）。RNA沉默可以在任一后生介导植物中或转录后水平的植物中。转录后基因沉默（PTGS）的一个方面是主要miRNA表达途径减少内源性基因（琼斯罗兹等，2006），这需要DCL1和拟南芥里的AGO1功能。另一个方面PTGS抵御外源核酸入侵主机（例如，转基因，病毒）通过siRNA的途
6、径，涉及不同组RNA依赖性的RNA聚合酶（迪纳普农村服务组织），的DCL，AGOs，和其他组件（2005 Voinnet）。例如，PTGS感基因（S-PTGS）通过dsRNA触发，在SGS3的帮助下通过RDR6被从单链RNA（ssRNA）转换（2006 Vaucheret）。Virusinduced基因沉默（VIGS）由双链RNA中间体引起复制病毒，RDR1-或RDR6介导形成的dsRNA，或高度结构化区的病毒RNA（Voinnet2005）。作为适应性免疫系统VIGS允许细胞通过顺式作用的siRNA针对性的降解外源性病毒入侵者。此外，VIGS还可以在未感染的细胞生成移动沉默信号（2004年B
7、aulcombe;2005年Voinnet）。因此，全身的植物感染需要通过特定有效机制病毒抑制宿主RNA沉默。作为反战略，许多植物和动物病毒已经进化，在所述siRNA途径和在不同阶段很多情况下抑制蛋白质，从而阻断宿主RNA沉默以及miRNA的途径（Anandalakshmi等。 1998年; Brigneti等人。 1998年; Kasschau和卡林顿1998年; Chapman等。 2004年; Chen等人。 2004年; Dunoyer等人。 2004年; Mlotshwa等。 2005年）。siRNA的抑制途径是伴随着siRNA的显著减少或完全消除。拟南芥里miRNA的干扰途径与发育
8、缺陷有联系，这部分phenocopiedAGO1基因突变体和突变体缺乏参与miRNA的生物合成和代谢（DCL1，HEN1和HYL1）。沉默抑制的几种分子机制在研究中，其中至今最好的发现是tombusviral P19蛋白。P19头到尾都由同型二聚体形成，能隔离siRNA双链和预防他们进入RISC（Vargason等人，2003; Ye等。2003年）。甜菜黄病毒和P1的P21/ HC-Pro萝卜花叶病毒（芜菁花叶病毒）也类似（叶和005年帕特尔;拉卡托斯等。 2006年）。研究提出Flock House 病毒B2蛋白结合dsRNA和siRNA和siRNA的抑制形成（Chao等人。2005年），
9、和P38抑制DCL4活动（Deleris等。2006年）。CMV2b确定了是在前两个抑制器中，这可能抑制敏感-GFP基因PTGS（S-PTGS）（Brigneti等人，1998），对miRNA的功能很少或几乎没有影响（Chapman等人，2004年）。就RNA沉默作用在CMV2b里的部位，我们调查其抑制机制。我们发现，CMV 2B还阻止miRNA诱发途径phenocopying AGO1突变等位基因异常发育。我们发现，CMV2b与AGO1直接互动并在RISC重建中抑制其裂解活性测定而且该AGO1募集病毒衍生的siRNA在体内。这些结果表明，CMV2b的AGO1裂解活性能减弱RNA沉默并对抗宿主
10、防御。结果CMV2b的抑制在拟南芥里会导致发育异常。CMV编码的2B蛋白是在前两个抑制器中，确定了能抑制PTGS（Brigneti等人。 1998年），但CMV上miRNA的功能很少或没有影响（Chapman等人，2004年）。考虑到来自温和应变的CMV（郭鼎2002）（Q株）2b抑制器先研究（Chapman等人，2004年），我们调查是否能从一个同源抑制器严重应变（FNY株）（佐和1990年Palukaitis）行为会不同。CMV（FNY）感染在拟南芥中引起严重症状，包括发育迟缓，节间距离缩短，扭曲茎，和型花小，这些还无法考证（无公开数据）。图1显示了FNY感染植物后2b蛋白变多，miRNA
11、含量升高，比如为miR168、星链和目标的mRNA（图1A面板的a，b，B 顶板，泳道1-3），表明对miRNA的途径有抑制作用。因为与miRNA的干扰途径是许多病毒抑制器一种常见的特点（马洛里等人。2002年; Kasschau等。 2003; Chapman等。 2004年; Dunoyer等。 2004年; Mlotshwa等。 2005年），我们推测感染植物的FNY分子机制可以归因于2b抑制器。最后，我们从两个CMV里比较了转基因拟南芥植物表达转基因35S-CMV 2B，FNY和Q FNY2b还有Q2b蛋白有51身份和62相似的氨基酸序列（佐和Palukaitis1990;郭丁2002
12、年）。约80（132104）初级转化的35S-FNY2b有轻重不一的发育异常（图1C）。最严重的转基因株系（例如FNY2b-1）（图1C，面板D-F）叶子过细长、狭窄、锯齿、并严重向上卷曲。线条的20，叶子似乎已失去了它们极性扭曲的叶柄。这些植物花卉都非常紧凑，狭窄的萼片和花瓣由间隙分开，并且大多不育。大约有一半的花仍未开放，而剩余花的花粉缺乏花药。线条较轻的株型（例如，FNY2b-3）显示锯齿，浅裂，或卷曲莲座叶，而因为植物的花朵含有短雄蕊，所以部分不育（图1C，板G-1）。由FNY2b-5（图1C，面板J-1）表达线条轻度发育缺陷。 这些植物很茂盛，有轻微卷曲或其抚平莲座叶具有较强的锯齿。
13、他们的萼片和花瓣转头，有部分损失正面和背面的身份;而他们的心皮和雄蕊依然茂盛。char-acteristics phenocopied ago1-25 和ago1-27，两个较弱AGO1突变等位基因形态（图1C，板M-O;羊肚菌等。2002年;数据未显示）。Northern和Western blot分析表明，表型的严重相关程度和FNY2b表达水平（图1B）。图1. CMV2B导致发育异常的拟南芥。 （A），CMV（FNY株）感染增强AGO1积累（图a）和miR168和miR168*（图b）。样本采集7或12天接种后（DPI）。仅缓冲液对照植物用处理（模拟）。每条泳道下面的数字指对装载标准化后控
14、制的相对于野生型的表达水平，（25S或5S种rRNA）。在35S-FNY2b线和CMV（FNY株）（B）的FNY2b转录和蛋白水平感染的植物。针对FNY2b多克隆抗体使用。 （顶板，泳道1-3）对于CMV的实验中，样品收集7或12dpi的。转基因系数列在上面。甲交叉反应带（星号）作为上样对照。 （C）形态的35S-FNY2b转基因株系的表型。照片拍摄于4周龄的幼苗，他们的第四个真叶，和成人的花朵的WT Col-0中（图a-c）和代表性的35S-FNY2b线路（1，3，和5），和3周龄幼苗，第二片真叶时，与成人ago1-27花（板M-O）。 （面板D-F）35S-FNY2b-1。 （面板克-i）
15、的35S-FNY2b-3。 （面板J-升）35S-FNY2b-5。板：板A，D，G，J，M，10毫米;板B，E，H，K，N，2毫米;面板c,f,i,l,o, 1 mm。 （D）的35S-FNY2b，一系列AGO1突变等位基因和WT Col-0中苗在的子叶期。 （图A）WT COL-0。 （面板B，C）极其严重35S-FNY2b线，未展开的子叶。 （图D-F）35S-FNY-3，35S-FNY-4和，35S-FNY-5。 （图G-I）ago1-36，ago1-25和ago1-27。板，3mm。在T2或随后几代，在野生型（WT）里容易分辨表型异常的35S-FNY2b 3-5和35S-FNY2b-8
16、（图1D，板A，D-F）。发芽后不久，3-5苗有窄和弯曲，或者杯形或者勺形，暗绿色phenocopying AGO1突变的等位基因的子叶（图1D，面g-）。模仿ago1-1和其他严重的自生能力AGO1等位基因的突变，复筛的极重度的转化体与未膨胀的子叶里，35S-FNY2b初级转化取得10，（图1D，板B，C），（Bohmert等人1998; Kidner和Martienssen2004;数据未显示）。严重的35S-FNY2b线真叶出现后不久就死了。在对比35S-FNY2b线，仅0.6的35S-的Q2b转基因株系（七1208）表现出明显的发育异常（数据未显示）。表型差异由FNY2b和Q2b表达引起，与他们的表达水平有关。多数的35S-Q2b和35S-FNY2b有可比性的转录水平（图1B;补充图S1A），但只5的含有几乎检测不到Q2B蛋白质。此外，大
