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1、植物中线虫的检验检测,小组成员：张忠锦、杨登品、 艾加灵、叶双琼、 朱克玉,植物寄生线虫概述 植物病原线虫的生态 植物病原线虫的形态与解剖 植物中线虫的检验检测,一、植物寄生线虫概述,线虫是一类低等的无脊椎动物地球上约万种，但目前只记载约260属5700多种 包括自由生活线虫（海洋、淡水和土壤中） 危害植物的病原线虫。 几乎所有的农作物都受到植物线虫的寄生。 人类最早发现的是小麦粒线虫（1743年）,植物线虫病症状：以畸形为主 1.顶芽和花芽的坏死，茎叶的卷曲或组织的坏死，形成叶瘿或种瘿等。 2.根部停止生长或卷曲，根上形成瘤肿或过度分枝，根部组织的坏死和腐烂等。 因此，表现为植株矮小，色泽失
2、常和早衰等症状，严重时整株枯死。,松材线虫病及其媒介昆虫,重要植物病害致病线虫,粒线虫属； 根结线虫属； 异皮线虫属； 滑忍线虫属； 茎线虫属； 剑线虫属； 长针线虫属。,危害方式：口针穿刺寄主，通过分泌有毒物质和吸收营养破坏寄主的细胞和组织，植物受到为害后，表现的症状与一般病害的症状相似 植物线虫还能作为其他病原物的自然传播介体 据 FAO保守估计，因为线虫为害，粮食和纤维作物损失约为12%； 蔬菜、花生、烟草和某些果树，损失超过20%；近年来国内蔬菜根结线虫危害严重,美国著名线虫学家J N Sasser认为，全美每年因线虫病害造成的农产品损失为58亿美元，全世界超过1000亿美元； 在我国
3、，仅大豆孢囊线虫病，造成的年损失大 1 亿美元；各种蔬菜损失达到30亿美元；水稻因潜根线虫危害，造成7%15的产量损失，这类线虫广泛分布在我国水稻产区，但迄今在国内尚未引起注意； 许多作物的根腐病或“烂根”，是生产中一个比较突出和复杂的问题，但人们很少去考虑线虫的因素，“作物的烂根，其中30左右与线虫相关”。,植物线虫危害的特点：主动侵袭、隐蔽性。 植物线虫对寄主致病性表现为： （1）机械损伤 （2）分泌有毒物质破坏寄主的细胞和组织 （3）与其它病原物对寄主复合侵染,二、植物病原线虫的生态,水-线虫是一类水生动物，植物病原线虫仍然保持水生习性；除了休眠状态的幼虫、卵和胞囊，线虫都需要在适当的水
4、中或土壤颗粒表面有水膜时才能正常活动和存活，或寄生在寄主植物的活细胞和组织内。 温度-不同线虫种类其发育最适温度不同、但一般在1530之间均能发育。在40 -50的热水中10分钟，即可杀死。在实验室，常用60 -65 ，3-5分钟杀死线虫。,土壤-土壤的温度和湿度(水分)是影响线虫的重要因素。土壤的温、湿度高，线虫活跃，体内的养分消耗快，存活时间较短；反之则存活时间就较长。 土壤长期淹水或通气不良也影响它的存活。 许多线虫可以休眠的状态在植物体外长期存活，如土壤中未孵化的卵，特别是卵囊和胞囊中的卵存活期更长。,线虫分布在从土表以下 5cm到 15cm土层，尤其是植物根际土壤中更多。 线虫在土壤
5、中的蠕动没有方向性。线虫在土壤中移动的范围很少超过30100cm。 线虫的传播途径：以被动传播为主，包括 人为传播：种子苗木调运及包装物 自然力传播：水流（灌溉水）及风、农具的携带等；昆虫（松墨天牛、棕榈象甲）,D,植物病原线虫的形态与解剖,外部形态 一般长管状两侧对称；尾部略尖；体形细小（长mm以下） 部分种类雌雄异形，雄虫线形，雌虫为柠檬形、洋梨形、肾形、球形和长囊形.,三、线虫虫体结构,体壁: 角质层; 下皮层; 肌肉层； 体腔； 体腔液（血液）。,内部结构-消化系统 生殖系统 神经系统 排泄系统等,体壁（角质层、下皮层、肌肉层）,A外表皮层 B内表皮层 C丝状层 D基质层 E边界层 F
6、外纤维层 G中纤维层 H内纤维层 I基底膜,D,排泄孔,侧区 侧带,体腔-体腔液,背面,腹面,肌肉,侧区,食道,生殖腺,消化系统,口,食 道,肠,直 肠,肛门,体部,峡部,食道腺,生殖系统,雌性生殖系统,卵巢,输卵管,受精囊,子宫,阴道,阴门,后阴 子宫囊,雄性生殖系统,精巢(睾丸),精囊,输精管,泄殖腔,附属交配器官,神经系统-由数百个神经细胞组成: 神经环是最显著的的结构; 侧神经; 亚腹神经; 亚背神经; 侧器神经.,C,四.进境木包装松材线虫的检疫方法,为了防止国外的松材线虫随木包装传入, 近几年来, 我们结合口岸木包装的检疫经验以及实验室分离检验鉴定松材线虫的实践, 探索出了一套进境
7、木包装松材线虫的检疫分离方法, 该方法与目前文献中报道的一些松材线虫检验方法相比, 具有检验样品量大, 技术简单容易掌握, 检验过程快速准确和检出率高等特点。现将该检疫方法介绍如下。,1、松材的辨别,松材线虫的寄主为针叶树, 尤以松树为主, 因此现场检疫首先要识别检验的木包装( 垫木、卡板、包装箱等) 是否是松材。松树的树皮红褐色、粗糙、鳞片状, 材质厚实, 较重,木纹清晰带油脂, 褐色至深褐色, 尚未干透的松材可散发出一阵幽幽的松脂香味, 经过辨皮色、看材质木纹、闻香味等几个方面的检查可将松材与其他杂木区别开来。,2、松材样品的选取,2.1多点取样, 增加取样覆盖率 为了取样的代表性和发现松
8、材线虫的机率, 不能图省事, 在一批货物中同一个点抽取足量的松材, 而应多点取样, 每点取 2 4 块长40cm 的松材, 增加取样的覆盖率。,2.2选带有蓝变症状的松材,松材线虫危害过的木材往往附有引致松材发生蓝变的真菌, 在现场检查时, 需要挑取有浅显蓝变的松材做样品。 对于蓝变的木材, 如果蓝变过于严重且材质又较轻时, 也不适宜作为样品, 因为这些木材往往是砍伐过久, 经过长时间的贮藏或运输的木材, 松材线虫会因环境条件、温度、湿度、水分的变化, 尤其是高温和失水而死亡, 从这些样品中分离出来的线虫往往是在木板表面上生活的小杆线虫或其他滑刃类线虫。因此要选取材质内部有蓝变的木材做样品。,
9、2.3选有虫蛀症状的松材,松材线虫是一种虫媒线虫, 在自然生态中, 它主要由天牛、象甲和吉丁虫作为媒介进行自然传播, 因此被天牛等甲虫钻蛀过的松材带有松材线虫的可能性也较大, 所以选取有虫蛀症状的松材做样品就会增加分离线虫的可能性。另外, 作为虫媒本身也会携带大量的线虫, 因此, 如在样品中发现天牛、象甲和吉丁虫, 也可拿来分离是否有松材线虫。,2.4选水分含量高、有松脂香味的松材,松树被砍伐后, 松材线虫依靠松材内的水分和养分继续存活一段时间, 当松材内的水分和养分消耗完毕后, 松材线虫也会自然死亡。松材的水分含量高, 有松脂香味从一个侧面反映出这些松材被砍伐的时间相对较短, 还有能保持线虫
10、赖于存活的必要条件, 因此选这样的松材做样品就可增加检出线虫的可能性。,2.5选取边材和材质较厚的松材,松材线虫为害的部位主要在边材, 很少有松材线虫在心材内( 树木的中心部位材质)生活, 在现场检疫中需要选取边材做样品, 通常边材的年轮轮纹距离较疏, 轮纹颜色淡褐色, 木质密度相对疏松( 不是很硬) ; 而心材的年轮轮纹距离较密, 颜色深褐色至黑褐色, 木质很紧密( 相对较硬) , 取边材做样品分离出线虫的可能性较大。,材质较厚的松材可抵抗不良环境的影响, 相应地延长线虫在松材内的存活时间, 厚度少于1cm 的松材, 容易失水干枯, 影响线虫的存活或容易受到外界高温的直接影响而死亡。因此,
11、在现场检疫中应选取厚度 115cm以上的木板或木方、垫木做样品。,3.样品的处理,样品取回实验室后, 选取需要分离的样品, 首先将样品锯成 15 20cm 长, 少于 1cm厚的木条或木片, 将木条或木片放入塑料桶中, 加水浸过松材浸泡 6 24h。然后将松材浸出液倒进线虫分离套筛内过滤线虫, 其方法是 100目筛在上方, 400 目筛在下方, 用自来水冲洗上筛, 将筛上物冲洗到下筛, 取去上筛, 再用水小心地从筛旁和筛的后边把留在400目筛的筛内物冲洗到培养皿中, 将培养皿移至解剖镜( 立体镜) 下观察有无线虫。,过筛冲洗的筛内物, 可通过漏斗法除去杂质, 其方法是先在漏斗中铺上双层面巾纸,
12、用止水夹夹住漏斗下方的胶管( 也可用小试管直接套在胶管中) , 将分离液体倒进漏斗里, 然后小心地从漏斗旁边把水加至漏斗 1/2 或 2/ 3 处( 应避免水流冲破面巾纸) , 静置6h 以上, 让线虫通过纸巾游动到下方的胶管里, 而杂质则隔离在纸巾上, 需要检验线虫时, 打开漏斗的止水夹, 取出适量的液体放进培养皿中, 移至解剖镜下检验, 此时液体中的杂质已经隔掉, 在解剖镜下就很容易找到线虫。采取同样方法, 在没有线虫分离套筛的情况下, 也可在塑料桶中浸泡了松材样品后,取出松材, 将浸出液静置 2h, 然后慢慢倒掉上层液体, 只留下桶底的液体, 把此液体移至漏斗中按以上方法过滤, 也可分离
13、非常干净的线虫液体, 便于在解剖镜下观察。,4.线虫的保存,4.1短期保存 将分离出来的线虫液体用吸管吸到盘尼西林瓶中, 封好盖子, 放在冰箱冷藏的保鲜盒里保存, 滑刃类线虫在此环境下可至少存活2 个星期。 4.2固定保存 在线虫悬浮液内加沸水, 使温度为 5658度, 经数分钟后可将杀死, 待悬浮液冷却后, 加 4% 的福尔马林固定液固定线虫( 在配置福尔马林固定液时, 加几滴甘油混合, 可使线虫不易变形) , 线虫在此固定液中可长时间保存, 便于留用, 随时取出观察。,5.镜检,线虫的检验一般是先在解剖镜( 立体镜)下检验, 发现线虫后怀疑是松材线虫的可用挑针挑取线虫至载玻片上的水滴中, 或用滴管把线虫吸到载玻片上, 盖上盖玻片, 放在显微镜下检验鉴定。还有一种方法, 就是将小培养皿中的线虫液直接放在显微镜下检验,或者用有机玻璃制作一种可卡在显微镜下观察线虫的培养皿型载玻片( 线虫用观察玻片) , 把线虫液倒进观察玻璃片内, 直接用显微镜观察玻片内的线虫是否带有松材线虫。,
