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1、微生物学实验-2,实验三 培养基的制备 实验四 高压蒸汽灭菌,实验三 培养基的制备,实验目的 实验内容 实验器材 实验方法 注意事项 实验报告 思考题,明确培养基的配置原理。 通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基 的一般方法和步骤。,实验目的,实验内容,1. 牛肉膏蛋白胨培养基的制备 2. 高氏一号培养基的制备 3.马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）的制备,1溶液或试剂： 牛肉膏，蛋白胨，琼脂，可溶性淀粉，葡萄糖，NaCl，KNO3， K2HPO43H2O，MgSO47H2O， FeSO47H2O， lmol/L NaOH lmol/L HCl。 2仪器或其他用具： 试管，三角瓶，烧杯，量筒，
2、玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙，电炉，高压蒸汽灭菌锅，pH试纸（pH 5.59.0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。,实验器材,牛肉膏 3.0g 蛋白胨 10.0 g NaCl 5.0 g 琼脂 15.0 20.0 g 水 1000 ml pH 7.47.6,牛肉膏蛋白胨培养基配方,可溶性淀粉 20.0g KNO3 1.0 g NaCl 0.5 g K2HPO43H2O 0.5 g MgSO47H2O 0.5 g FeSO47H2O 0.01 g 琼脂 15.0 20.0 g 水 1000 ml pH 7.47.6,高氏一号培养基配方,马铃薯（去皮） 200g 葡萄糖 20 g 琼脂
3、1520 g 水 1000 ml pH 自然,PDA培养基的配方,制法：先将新鲜无病害的马铃薯洗净，去皮后切成小薄片，称200克，加水1000毫升，煮沸20分钟后过滤，其滤汁为马铃薯煮汁，然后加琼脂和葡萄糖煮溶，后补足水分至1000毫升，装管（瓶）灭菌备用。,Na2HPO412H2O 1.3 g KH2PO43H2O 0.36 g NaCl 0.5 g 脱脂牛奶 100ml 琼脂 15.0 20.0 g 水 900 ml pH 7.2,脱脂乳培养基配方,1.称量 在上述烧杯中先加人少于所需要的水量，按培养基配方比例依次准确地称取放入烧杯中用玻棒搅匀。 2.溶化 在石棉网上加热使其溶解，并加水补
4、足体积。 3.调pH 在未调 pH前，先用 pH试纸测量培养基的原始 pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入 lmolL NaOH，边加边搅拌，并随时用 pH试纸测其pH，直至pH达7.6。反之，用 lmolL HCl进行调节。,实验方法,4. 过滤 用滤纸或多层纱布过滤。一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去。 5. 分装 按实验要求，可将配制 的培养基分装入试管内或三角烧 瓶内。分装试管，其装量不超过 管高的1/5，灭菌后制成斜面。,6. 加塞 在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进人培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。 7. 包扎 在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时
5、冷凝水润湿棉塞，其外再用绳子扎好。注明培养基名称、组别、配制日期。 8. 灭菌 将上述培养基以 0.103 MPa 121，20min高压蒸汽灭菌。,9. 摆斜面 将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。,1. 蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。 2. 在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。配置培养基时，不可用铜或铁锅加热熔化，以免离子进入培养基中，影响细菌生长。 3. pH不要调过头，以避免回调而影响培养基内各离子的浓度。 4.
6、分装过程中，注意不要使培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。,注意事项,1培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？ 2在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？为什么？,思考题,实验四 高压蒸汽灭菌,实验目的 实验原理 实验器材 实验方法 注意事项 思考题,了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围。 学习高压蒸汽灭菌的操作方法。,实验目的,高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加热灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点
7、增高，得到高于100的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。 在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。,实验原理,灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系,牛肉膏蛋白胨培养基 高氏一号培养基 PDA培养基 培养皿、试管、三角瓶、移液管 手提式高压蒸汽灭菌锅等,实验器材,1. 加水：将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水使水面与三角搁架相平为宜。,实验方法,2. 放回内层锅，并装入待灭菌物品。,3. 加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。
8、再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺 栓。,4. 通电加热，待冷空气完全排尽后，关上排气阀。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用0.1Mpa，121.5，20min灭菌。 5. 灭菌所需的时间到后，关闭电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。 6. 将取出的灭菌培养基放入37温箱培养24h，经检查若无杂菌生长，即可待用。,每组准备下列物品（灭菌）,1.培养基2瓶（ 500ml培养基用250ml三角瓶分装） 2.试管10支（内装3ml培养基） 3.无菌水1瓶（150ml三角瓶，内装99ml水、玻璃珠） 4.试管4支（内装9ml水 ） 5.培养皿2包（20个）,1切勿忘记加水，同时加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。 2压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者。,注意事项,1高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么要待压力降低为“0”时才能打开排气阀，开盖取物？,思考题,知识回顾Knowledge Review,
