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1、第三章 细胞化学和组织化学,细胞化学和组织化学(cytochemistry and histochemistry)技术是以细胞学、组织学为基础，运用物理的和化学的方法来显示细胞组织结构中各种化学物质(如无机物、脂类、蛋白质、维生素、核酸、酶等)的定性、定位、定量的技术，从而分析、研究生物在生理或病理状态下，细胞和组织的代谢、功能及形态的变化规律。,组织化学源自比利时植物学家RaspaiI(1830年)发表在生理学中使用显微镜观察化学物质的论著。 初期(1830-1870年)的组织化学主要解释生物界中的生理现象。 (l890-1920年)随着显微镜的改进和组织化学染色技术的发展，组织化学开始脱离
2、生理学而趋向于阐明组织细胞的结构及化学组成，即从生理组织学的概念转为显微化学。 差不多与此同时(1900-1935年)，发现疾病组织中出现的物质变化，更促进了化学技术在病理学染色方法中的应用，也丰富了在显微镜下显示无机物、色素、脂类、糖类、蛋白质、核酸等物质的组织化学内容，此后又出现了酶的组织化学等。由此可见，“组织化学”一词的含意是随时代而变化的，由定位趋向于与定量相结合的研究。,第一节 细胞化学和组织化学的基本方法,与常规的组织学方法一样，细胞化学和组织化学方法也同样需要经过取材、固定、制片、染色等过程，只是要求更加严格。 一、取材 组织块不宜过大，光镜标本一般为1.5cmlcmO.3cm
3、大小，电镜标本的大小约在05mm左右。 酶组化之目的使用时，最好在低温的环境下(04)操作。,二、固 定 固定既要最有效地保存细胞、组织内的化学成分和酶的活性，防止其弥散、移位、溶解、丢失，同时还必须保持细胞、组织良好的形态结构，防止细胞、组织收缩、膨胀、变性、自溶。因此，根据组织内的化学物质、酶的特点，选择适宜的固定剂是非常必要的。,(一)常用的细胞和组织化学固定剂的配制,l、Baker甲醛-钙固定液(固定时间24/小时) 商品甲醛10ml，10%氯化钙l0ml，蒸馏水80ml， 此固定液为细胞和组织化学技术中最常使用的固定液，适合各种染色方法。 2、Lillie磷酸缓冲-甲醛液 3、多聚甲
4、醛-磷酸缓冲固定液(多聚甲醛效果优于甲醛) 4、戊二醛磷酸缓冲固定液(固定时间1 60分钟，适用于电镜) 5、甲醛-蔗糖-磷酸缓冲固定液(适用于多糖类及蛋白质) 以上固定液都必须在冷的环境下(0 4 )工作。,(二)常用的固定方法,1、浸泡固定法：将固定液置于0一4C冰箱中预冷，检材浸入冷固定液中2一12小时(在冰箱中进行)或者更长。 2、原位冷固定法：将动物麻醉后，在活体情况下，在组织上加冰后，一边快速取材，一边向组织器官滴加预冷的固定液，检材取出后，再用浸泡法固定30分钟-1小时，甚至更长时间。 3、灌注固定法：从心血管途径将固定剂灌注到全身或某一个器官，使细胞保持生活时的状态而不发生移位
5、，固定后再迅速取材。,三、制 片,涂片法、石蜡切片法、冰冻切片法 最常使用的为恒冷箱冰冻切片法。,四、注意事项,1、实验所用的器械、器皿都必须清洁无污染。 2、配制试剂时应使用双蒸馏水。 3、固定、取材都应在冷的环境下进行。 4、各种试剂的pH值都要调准，否则影响反应结果。 5、所用试剂要纯，都必须达到分析纯(AR级)。 6、同时、同条件情况下做阴性和阳性对照。 7、了解和掌握被检组织中所要测定的化学物质或酶的各种特性，做到胸中有数，正确分析实验结果。,第二节 无机物的检测方法,一、显示组织中钙沉着的方法 钙(calcium)广泛存在于体内各器官中。 一般在H-E染色中，钙盐呈蓝黑色或蓝紫色颗
6、粒及片块状沉淀。虽说H-E染色方法可以证明有钙的存在，但特异性不强。 特殊的显示钙的方法较多，如Kossa的金属置换法、Gomori钙块染法、McGeeRuSeell核固红法等。,以下介绍McGee-Ruseell核固红法。 1、操作步骤 (1) 石蜡切片常规脱蜡至水。 (2)核固红染液染色2一10分钟。 核固红染液的配制：核固红2g，蒸馏水100ml洗涤2次，剩下约0.25g核固红残余物，再溶于蒸馏水100ml。 (3)蒸馏水稍洗，常规脱水透明，中性树胶封片。 2、结果：钙盐沉积处红色；其他组织深浅不同的淡粉红色。 3、注意事项 (1)钙盐易被酸性溶液溶解，适宜于用中性甲醛溶液固定，固定时间
7、不宜过长，以免甲醛溶液酸化影响结果。 (2)铁妨碍钙的显示，要避免使用铁质容器。,二、铜质显示法 显示铜的方法较多，如Howell红氨酸改良法。 此法不显示生理量铜。整个操作过程中，避免接触金属器皿，以免产生假阳性。 三、显示铅的玫棕酸法 体内过分含铅的情况下，能用玫棕酸法显示骨和其他组织中铅的含量。玫棕酸法以铅和玫棕酸钠蟹合剂反应为基础，铅盐呈红色。并适用于脱钙后的骨组织。,第三节 有机物的检测方法,一、糖类染色方法 糖类广泛存在于机体的组织中，化学成分复杂，种类繁多，分为单糖、多糖、黏多糖、糖蛋白、黏蛋白、糖脂。 糖原是天然存在的多糖，为储存糖；大量存在于肝细胞、骨骼肌、心肌内。糖类容易溶
8、解于水，因此不能选择水溶性固定液固定组织。 糖原的常规染色为过碘酸-Schiff（PAS）反应法,过碘酸-Schiff（PAS）反应法 基本原理：过碘酸（periodic acid）是一种氧化剂，它可把多糖的葡萄糖分子两个相邻的带有羟基的-C-C-键打开，而生成醛基再与染色剂结合。Schiff试剂中的碱性复红(fuchsin basic)是一种混合物，经亚硫酸和二氧化硫的作用，醌式结构的双键被破坏而消失，成为无色复红，再经过氧化后的醛基与无色复红液进行结合呈紫红色。 组织死亡后，糖原很快就分解为葡萄糖，迅速取材、固定是非常重要的。 该染色方法不仅能显示糖原。而且还能显示中性黏液性物质和某些酸性
9、黏液性物质，以及脑垂体、神经髓鞘、脂质色素、淀粉祥物质、基膜、软骨及真菌等等。,1、染色步骤 (1) 经常规组化固定液、Carnoy固定液、Bouin固定液固定组织。 (2) 常规石蜡包埋、切片、脱蜡至水。 (3) 1%过碘酸液氧化10分钟。 (4) 自来水充分洗3分钟，蒸馏水过洗。 (5) 入Schiff液10一20分钟(遮光)。 Schiff液的配制：碱性品红1g ，蒸馏水(煮沸) 200mI，振荡5分钟，冷却至50过滤，加入lmol/LHCl20ml，冷至25 时加偏重亚硫酸钠46g， 遮光放置12一24小时后，加入活性炭(吸色) 2g(若液体颜色较淡可省去此步)，摇荡1分钟后过滤，将滤
10、液遮光保存在04 处备用。 (6)自来水流水冲洗15一20分钟，显色(红色)。 (7)苏木精复染5分钟。 (8)流水冲洗5一10分钟。 (9)常规脱水、透明、封片。,2、结果：糖原及PAS反应阳性物质为红色；其他为紫蓝色。 3、注意事项 (1)Schiff液的配制是本方法的关键，否则将不显色。 (2)SO2充分时，能使碱性品红变成无色品红，此时配出来的溶液呈淡黄色清亮液体，可以省去活性炭吸色这一步骤。在使用中染液逐渐变无色。 (3)反应的强弱与氧化的时间及氧化的强度有关。过碘酸的浓度不宜过高，氧化时间不能太短，也不能太长，要适当掌握。一般氧化10-12分钟。 (4)一定要做好对照。,二、核酸的
11、显示方法 核酸是细胞内染色质和核仁不可缺少的组成部分。其主要成分为核苷酸，核苷酸由磷酸和核苷组成。 根据生物功能及化学结构可以将细胞内的核酸分为两种，核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸（DNA)。 RNA主要存在于胞质中，核仁、核质、染色体中含量少，在蛋白质的合成上起着重要作用。 DNA大部分存在于细胞核中，是遗传的物质基础。 RNA、 DNA的显示的常用方法有Feulgen法、甲基绿-派洛宁法等。,1、Feulgen法,反应原理：标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色团，故
12、可呈现出紫红色。也就是说, DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。 2HCl+Na2S2O52NaCl+SO2+H2SO3,操作过程： （1）切片常规脱蜡至水。 （2）蒸馏水洗，1NHCI水溶稍洗。 （3）浸入1NHCI水溶液60，8-10分钟。 （4）取出后，1NHCI水溶液稍洗，蒸馏水洗数次。 （5）入Schiff氏液中室温下，暗环境30-90分钟。 （6）流水冲洗数分钟。 （7）常规脱水、封片。 结果：DNA呈紫红色。,注意事项： （1） 对照切片的制做 （2） 固定剂的选择：一切好的组织学固定剂均适用于Feulgen反应，
13、以OsO4和Carnoy效果较好 （3）水解时间：适当的水解时间一般为812min。 （4）Schiff试剂的配制方法也可影响DNA的染色反应。 （5）5%亮绿淡复染，使胞浆及其它组织呈绿色。,2、改良的甲基绿-派洛宁法,甲基绿-派洛宁染色的原理并不十分明了，有的学者认为甲基绿染DNA，派洛宁染RNA不是化学作用，而是两种核酸的聚合程度，甲基绿染高聚分子的DNA，而派洛宁染低聚分子的RNA。而有的学者认为，甲基绿和派洛宁在水中分离后，都产生带正电荷的离子，甲基绿电离后产生两个正电荷，碱性较强，与细胞核结合；派洛宁电离后产生一个正电荷，碱性较弱，与细胞质结合。,1、操作步骤：略 2、结果：RNA
14、红色，DNA蓝绿色。 甲基绿-派洛宁染色液的配制:,三、蛋白质显示法,蛋白质的基本单位是氨基酸,肽键将不同的氨基酸结合在一起,除氨基和羧基之外,还含有其它基团,如:羟基,硫氢基,二硫基等.依其结构特点可分为:酸性氨基酸和碱性氨基酸；芳香族氨基酸:苯丙氨基酸,酪氨基酸；杂环类氨基酸:组氨基酸,色氨基酸,亚氨基酸,脯氨基酸,羟脯氨基酸。,目前应用 1. 用于蛋白质的一般定性 确定是否为蛋白质 确定蛋白质的酸碱性 显示蛋白质的特殊基团 2. 用于蛋白质功能定性和定位：目前,研究蛋白质功能定性和定位时多用酶组织化学法,配体受体结合法,免疫组化法以显示特殊的蛋白质.,细胞化学和组织化学显示蛋白质，只能利
15、用某些氨基酸的反应。由于在动物组织中通常没有游离的氨基酸，所以如用测定某种氨基酸方法得到阳性结果，即表明它是某一类蛋白质。 显示蛋白质的汞-溴酚蓝法 显示碱性蛋白质的碱性固绿法 显示蛋白质结合性氨基的茚三酮- Schiff反应 显示酪氨酸、色氨酸、组氨酸的偶联四氮盐反应,四、脂类染色法,组织中的脂类 ：单纯脂类 (脂肪酸)、醇的化合物(如:甘油三脂等)、 复合脂类 如磷脂(卵磷脂,脑磷脂) 、脂类（鞘磷脂）、 糖脂(脑苷脂,神经苷脂) 、衍生脂类（胆固醇）、 肾上腺素 、性激素 显示脂类的基本原理 ：用易溶于脂类的染料,使之溶于所检的脂质(如脂滴)中,使组织内的脂类着色.,常用方法： 苏丹黑B
16、法、油红O法、硫酸尼罗蓝法 、苏丹染色法等 基本要求 不用石蜡切片. 固定剂一般用Formalin保存磷脂较好. 方法: 物理法:脂溶性染料,不溶于水,属偶 氮染料.常用苏丹,苏 丹黑 ,油红O等. 化学方法:硫酸尼罗蓝显示脂肪酸. 选择性提取法(对照),实验举例:苏丹黑B法 原理：苏丹黑为偶氮染料,具有脂溶性,可溶于无水酒精,但不溶于水(常用70%酒精饱和液)。当组织切片入染液时,苏丹黑B便离开染液而溶于组织内的脂质(如脂滴中)使组织内脂类着色。 标本: 兔肾上腺和睾丸横冷箱切片,10m厚,不固定(或用10%Formalin固定10分钟后水洗)。 方法 ： 入蒸馏水洗 于70%乙醇内涮洗 入苏丹黑B 70%B饱和液,染510分钟 于50%酒精内浸洗 蒸馏水中洗 入Mayer苏木精(复染细胞核)1分钟 自来水冲洗510分钟 入蒸馏水 甘油明胶(或Ap
