沙门菌的检验技术讲解

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1、沙门氏菌（Salmonella）的检验,DANIEL ELMER SALMON, (1850-1914) 美国兽医微生物和病理学家。是美国授予的第一位兽医学博士。1884年任美国农业部畜牧局 首任局长。他首次从病猪中分离出猪霍乱沙门氏菌。在医学微生物中通用的沙门菌一词，就是为纪念他而以 他的名字命名的。,沙门菌（Salmonella）,是一大群寄生于动物肠道内生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌,一、沙门氏菌生物学特性,大小0.61.023um，无芽孢，一般有鞭毛(鸡沙门菌除外)，无荚膜，多数有菌毛，革兰氏阴性杆菌，需氧或兼性厌氧，最适生长温度为3537，最适pH值为6.87.8。,1、沙门

2、菌生物学性状,G-杆菌 0.6-1.0um2-4um 周身鞭毛，有菌毛。,形态大小,2、病 原 学,生化反应,不分解乳糖（亚利桑那菌除外），分解葡萄糖产酸产气（伤寒沙门菌产酸不产气）。 多数产生H2S，不产生靛基质，不液化明胶，不分解尿素，不产生乙酰甲基甲醇，多数能利用枸橼酸盐，能还原硝酸盐为亚硝酸盐，在氰化钾培养基上不生长。,3、流行病学,易感动物：各种年龄的动物均感染，幼畜最易感 传播途径： 主要消化道、呼吸道、伤口等 子宫内感染（垂直传播） 内源性感染（带菌现象普遍),沙门氏菌属致病性,潜伏期一般6-72小时，主要症状为恶心、呕吐、腹绞痛、腹泻、发热寒颤头痛。病程一般12天或更长。感染剂

3、量为1520个菌，死亡率达14%。最易感群体是年幼儿童、虚弱者、年长老人、免疫缺陷者等。 污染源主要是人和家畜的粪便 可以存在于多类食品中,二、沙门菌病简介,目前至少有67种O抗原和2000个以上血清型，所致疾病称沙门菌病。 肠热症-是伤寒病和副伤寒病的总称，主要由伤寒杆菌和甲、乙、丙型副伤寒杆菌引起。 急性肠炎（食物中毒）-是最常见的沙门杆菌感染。多由鼠伤寒杆菌、猪霍乱杆菌、肠炎杆菌等引起。 败血症-常由猪霍乱杆菌、丙型副伤寒杆菌、鼠伤寒杆菌、肠炎杆菌等引起。,鸡白痢,三、沙门氏菌检验,中华人民共和国国家标准,GB/T 4789.4-2010,微生物学检验,本标准代替GB/T 4789.4-

4、2008 食品卫生微生物检验沙门氏菌检验。 本标准与GB/T 4789.4-2008 相比，主要变化如下： 修改了标准的中英文名称； 修改了标准的范围； 修改了培养基和试剂； 修改了设备和材料； 修改了附录A。 本标准的附录A、附录B 为规范性附录。 本标准所代替的历次版本发布情况为： GB 4789.4-84、GB 4789.4-1994、 GB/T 4789.4-2003、GB/T 4789.4-2008,前 言,本标准规定了食品中沙门氏菌（Salmonella ）的检验方法。 本标准适用于食品中沙门氏菌的检验。,范 围,设 备 和 材 料,除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他还有：,

5、冰箱：2 5 。 恒温培养箱 均质器 振荡器 电子天平：感量0.1g 无菌锥形瓶:容量500mL，250 mL 无菌试管,无菌培养皿 无菌吸管 无菌毛细管 pH 计或pH 比 色管或精密pH 试纸 全自动微生物生 化鉴定系统,培 养 基 和 试 剂,缓冲蛋白胨水（BPW ） 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液 亚硫酸铋（BS ）琼脂 HE 琼脂 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD ）琼脂 沙门氏菌属显色培养基 三糖铁（TSI）琼脂,蛋白胨水、靛基质试剂 氰化钾（KCN ） 培养 尿素琼脂 赖氨酸脱羧酶试验培养基 糖发酵管 邻硝基酚 -D 半乳糖苷（ONPG）培养基 半固体琼脂

6、 丙二酸钠培养基 沙门氏菌O 和H 诊断血清。 生化鉴定试剂盒,操 作 步 骤,1、前增菌第一步使食物样品在含有营养的非选择性培养基中增菌，使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态。 2、选择性增菌在含选择性抑制剂的促生长培养基中间，样品进一步增菌的一个步骤。此培养基允许沙门氏菌持续增殖，同时阻止大多数其他细菌的增殖。 3、选择性平板分离这一步采用固体选择性培养基，抑制非沙门氏菌的生长，提供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别。 4、生物化学筛选排除大多数非沙门氏菌。也提供了沙门氏菌培养物菌属的初步鉴定。 5、血清学技术提供了培养物菌种的鉴定。,检 样,25g(ml)样品+225mlBPW,1

7、ml+TTB10ml,1ml+SC10ml,361 ，8h-18h,BS,XLD(或HE、显色培养基),挑取可疑菌落,42 1 ，18h24h,36 1 ，18h24h,36 1 ，40h48h,36 1 ，18h24h,沙门氏菌检验程序,生化鉴定 试剂盒 或全自动 微生物 生化鉴定 系统+,A1,A2,A3,反应 结果 与左侧 描述 不符,甘露醇+、山梨醇+,ONPG-,沙门氏菌，血清学试验,非沙门氏菌,报 告,TSI，赖氨酸，NA，靛基质，尿素（pH7.2），KCN,反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN 和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常，按表4可判定为沙门氏菌。如有 2项异

8、常为非沙门氏菌。,PDF 文件使用 “pdfFactory Pro“ 试用版本创建 ,综合以上生化实验和血清学鉴定的结果，报告25g（ml）样品中检出或未检出沙门氏菌。,结 果 与 报 告,前增菌：使食品加工过程中受伤的沙门菌细胞恢复活力 未经加工过的食品，检验前不需要前增菌 前增菌：25克（加工食品）+225毫升缓冲蛋白胨水 37度培养4小时（干蛋品1824小时）。,（一）前增菌,沙门氏菌前增菌培养基,缓冲蛋白胨水(BPW) 肉汤：,是基础增菌培养基，不含任何抑制成,分，有利于受损伤的沙门氏菌复苏。使受 损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状 态。2003版本标准仅用于加工食品或冷冻 食品的前

9、增菌。,PDF 文件使用 “pdfFactory Pro“ 试用版本创建 ,（二）选择性增菌,轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1 mL，转种于10 mL TTB内，于42 1 培养18 h24 h。同时，另取1 mL，转种于10 mL SC 内，于36 1 培养18 h24 h。 一种增菌剂不可能适合所有的沙门菌，所以，要同时使用两种以上的培养基增菌,同时使用TTB、SC 2003版本国标还有MM AOAC：TT、SC FDA：RV、TT ISO：RV、SC,选择性增菌的目的是最大可能的检出沙门氏菌， 原则上必须使用两种选择性分离增菌液，一种是抑 制除沙门氏菌以外其肠道菌的生长，一种是在不影

10、响其他肠道菌生长的情况下促进沙门氏菌的生长。,PDF 文件使用 “pdfFactory Pro“ 试用版本创建 ,沙门氏菌的增菌液,l 四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB)：含有胆盐， 抑制革兰氏阳性球菌和部分大肠埃希氏菌的 生长，而伤寒与副伤寒沙门氏菌仍能生长。,l 亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）：可对伤寒及 其他沙门氏菌作选择性增菌，亚硒酸与蛋白 胨中的含硫氨基酸结合，形成亚硒酸和硫的 复合物，影响细菌硫代谢，从而抑制大肠埃 希氏菌、肠球菌和变形杆菌的增殖。,PDF 文件使用 “pdfFactory Pro“ 试用版本创建 ,（三）分离培养,分别用接种环取增菌液1 环，划线 接种于一个BS琼脂平板

11、和一个XLD琼 脂平板（或HE 琼脂平板或沙门氏菌属 显色培养基平板）。于36 1 分别 培养18 h24 h（XLD琼脂平板、HE琼 脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板） 或40 h48 h（BS琼脂平板），观察各 个平板上生长的菌落，各个平板上的菌 落特征见表1。,PDF 文件使用 “pdfFactory Pro“ 试用版本创建 ,表1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征,返回,使用BS、XLD、HE、沙门氏菌显色培养基,2003版本国标：BS、DHL（或HE、WS、SS）,FDA：BS、XLD、HE AOAC：BS、XLD、HE,ISO：phenol red brilliant g

12、reen琼脂、BS或HE,为了最大可能的检出沙门氏菌，原则上 必须使用两种以上选择性分离培养基。,沙门氏菌分离培养基,PDF 文件使用 “pdfFactory Pro“ 试用版本创建 ,沙门氏菌分离培养基,l 亚硫酸铋琼脂（BS）：含有煌绿、亚硫酸铋 能抑制大肠埃希氏菌、变形杆菌和革兰氏阳 性菌的生长，但对伤寒、副伤寒等沙门氏菌 的生长无影响。伤寒杆菌及其他沙门氏菌能 利用葡萄糖将亚硫酸铋还原成硫酸铋，形成 黑色菌落周围绕有黑色和棕色的环，对光观 察可见有金属光泽。该培养基制备过程不宜 过分加热，以免降低其选择性，应在临用时 配制，超过48 h不宜使用。,PDF 文件使用 “pdfFactor

13、y Pro“ 试用版本创建 ,l 沙门氏菌菌落形态：,黑色有金属光泽、 棕褐色或灰色，菌 落周围培养基可呈 黑色或棕色；有些 菌株形成灰绿色的 菌落，周围培养基 不变。,PDF 文件使用 “pdfFactory Pro“ 试用版本创建 ,l HE琼脂：在保证细 菌所需营养的基础 上，加入了一些抑,制剂，如：胆盐、 柠檬酸盐、去氧胆 酸钠等，可抑制某 些肠道致病菌和革 兰氏阳性菌的生长， 但对革兰氏染色阴 性的肠道致病菌则 无抑制作用。 PDF 文件使用 “pdfFactory Pro“ 试用版本创建 ,l 沙门氏菌在HE琼脂上的菌落形态：蓝绿 色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑 色；有些菌株

14、为黄色，中心黑色或几乎全 黑色。,PDF 文件使用 “pdfFactory Pro“ 试用版本创建 ,lXLD琼脂：培养基中含有去氧胆酸 钠作指示剂，在该浓度下的去氧胆 酸钠也同时作为大肠埃希氏菌的抑 制剂，而不影响沙门氏菌属和志贺 氏菌属的生长。,PDF 文件使用 “pdfFactory Pro“ 试用版本创建 ,l XLD琼脂：粉红色，带或不带黑色中心，有 些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现 全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或 不带黑色中心。,PDF 文件使用 “pdfFactory Pro“ 试用版本创建 ,l XLD培养基分离沙门氏菌和志贺氏菌的敏感 性超过了传统培养基，如

15、：EMB、SS。因这 些培养基尚有抑制志贺氏菌属生长的潜在因 素，故本培养 基是分离鉴定 沙门氏菌及志 贺氏菌属的可 靠培养基。在,国外广泛使用。,PDF 文件使用 “pdfFactory Pro“ 试用版本创建 ,l 沙门氏菌显色培养基主要用于快速筛选、分 离沙门氏菌。其基本原理：利用沙门氏菌特 异性酶与显色基团的特有反应，使色原游离 出来，沙门氏菌在培养基上呈紫色或紫红色。 而大肠埃希氏菌等其他肠杆菌呈蓝绿色。,沙门氏菌 辛酸脂酶,色原-特定结合物 无色,色原特定结合物 游 离,显色 PDF 文件使用 “pdfFactory Pro“ 试用版本创建 ,SS琼脂,上面的志 贺氏菌和 沙门氏菌,PDF 文件使用 “pdfFactory Pro“ 试用版本创建 ,SS琼脂上面的沙门氏菌,PDF 文件使用 “pdfFactory Pro“ 试用版本创建 ,DHL琼脂上面的沙门氏菌,PDF 文件使用 “pdfFactory Pro“ 试用版本创建 ,BS琼,脂,上