《湖南省农业技术规程 - 湖南农产品质量安全网》由会员分享，可在线阅读，更多相关《湖南省农业技术规程 - 湖南农产品质量安全网（137页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、HNZ087-2015湖南省农业技术规程HNZ087-2015柑橘(类似)病毒病分子检测技术规程Technical regulations for molecular detection of citrus virus and viroid湖南省农业委员会制定发布日期：2015年10月29日柑橘(类似)病毒病分子检测技术规程为了规范柑橘（类似）病毒病分子检测操作技术，制定本规程。1 实验室条件具备柑橘（类似）病毒病分子生物学检测所需的实验场所、仪器和实验管理条件。2 技术人员资质要求从事分子生物学检测的人员应具备仪器操作和分子技术操作的能力，能力应根据相应的专业教育、培训、经验和（或）可证明的
2、技能进行资格确认。3 检测对象为我国发生的柑橘（类似）病毒病害，包括柑橘衰退病、柑橘碎叶病、柑橘黄龙病、柑橘裂皮病、温州蜜柑萎缩病。每种病毒病单独检测。4 检测样品要求采集树体四个方向上当年抽生的枝条。对于枝条少的树体，至少采集3片带有叶柄的完全展开叶片。样品运输过程中，需要进行保湿处理（如用打湿的吸水纸包裹枝条或叶片的切口处）。样品到达实验室后，经保湿处理后贮藏在4低温环境，并按照附件1登记样品信息。样品在采集后三天内完成后续的样品制备工作。5 样品制备去除叶片，枝条用75%酒精棉擦拭，再用吸水纸吸干。枝条清洗干净后，将剥取的韧皮部切成1cm小段。对于叶片样品，去除叶柄，同样经酒精擦拭、吸水
3、纸吸干后，再切成小块。混合同一树体的枝条（或者叶片）样品，取混合样直接进行核酸提取，或者装入自封袋内，立即放于液氮中冷冻，保存于-80冰箱。6 核酸提取对于柑橘衰退病、柑橘碎叶病、柑橘裂皮病和温州蜜柑萎缩病的检测，提取组织的总RNA；对于柑橘黄龙病的检测，提取组织的总DNA。具体操作分别参考附件2和3。每份样品的核酸物质分装一部分，放置于-80 冰箱中，以备复检。7 反转录（Reverse Transcription）用提取的RNA进行反转录，合成cDNA。反转录的反应体系如下： dNTPs（1 mmol/L）5 L， 5 buffer 5 L， RNasin（30U/L）0.5 L， 下游引
4、物（10 mol/L）0.5 L（引物序列见附件4）， M-MLV反转录酶（200 U/L）0.5 L，RNA 50 ng5g，最后加 DEPC 处理过的水至 25 L。反应液在42 处理1 h后，再进行95 处理10min终止反应。反应在PCR 仪上进行。8 聚合酶链式反应（PCR）以反转录合成的cDNA 或DNA为模板，用相应的引物（引物见附件4）对其进行 PCR扩增。反应体系为： 10 PCR Buffer 2 L， dNTPs (1 mmol/L) 5 L， 上游引物 (10 mol/L) 0.5 L， 下游引物(10 mol/L) 0.5 L， 核酸模板0.11 g， Taq DNA
5、聚合酶(2 U/L) 0.15 L，最后加灭菌去离子水至 20 L。反应步骤为：94预变性5 min，之后94变性30 sec，退火（退火温度见附件4）15sec，72延伸60 sec，35个循环，最后72延伸10 min。反应在PCR 仪上进行。9 凝胶电泳PCR反应完成后，取扩增产物，将PCR扩增产物与2 L上样缓冲液（10）混合，加入到1.0%琼脂糖凝胶（含有0.5g/ml溴化乙淀）的点样孔内，同时设置标准分子量DNA作为片段大小标准，在1TAE 的缓冲液中进行凝胶电泳，电泳电压120 V，电泳时间约30 min。将电泳后的琼脂糖凝胶放置于凝胶成像系统内，打开紫外灯，在凝胶成像系统控制软
6、件上观察PCR扩增条带。10 检测对照在样品检测的PCR和凝胶电泳操作过程中，同时设置阳性对照和空白对照。阳性对照的PCR模板为从经过分子生物学检测和生物学检测确诊的病原样品中提取的核酸物质。空白对照的PCR模板为PCR反应所用的灭菌去离子水。11 结果判定根据凝胶电泳的结果进行判定：检测样品和阳性对照均出现目的片段大小的扩增条带（见附件4），空白对照无目的片段扩增条带，该检测样品判为阳性，即该检测样品携带病原；阳性对照出现目的片段大小的扩增条带，检测样品和空白对照中均无目的片段扩增条带，该检测样品判为阴性，即该检测样品未检出病原。12 检测材料废弃处理经检测后的植物材料废弃物应进行高温消毒后
7、再做垃圾处理。13 技术术语13.1 分子生物学检测以DNA或RNA为诊断材料，通过PCR或RT-PCR技术分析基因的存在从而为病害诊断提供更直接、更科学的信息。13.2 生物学鉴定利用受（类似）病毒侵染能产生专化症状的指示植物进行（类似）病毒检测。13.3 反转录对于RNA病毒，以其RNA为模板，通过反转录酶合成DNA的过程。13.4 聚合酶链式反应（PCR）是用Taq DNA聚合酶合成、扩增病原物特异DNA片段的一种方法。编写单位：湖南农业大学编写人员：戴素明 邓子牛 李大志 李芳 陈岳文等52附件1样品检测跟踪档案序号样品信息检测项目样品编号样品保存样品检测品种/砧木来源地采样时间送样人
8、联系方式收样人收样时间检测人检测时间检测结果12附件2:RNA提取操作步骤（1）取样品放入液氮遇冷的研钵，加入液氮后使用研磨棒将样品研磨至粉末状，再将0.1g粉末转入到2 mL的离心管中。（2）立即向离心管加入Trizol提取液1 mL，迅速颠倒混匀，室温放置5 min，使细胞完全裂解。（3）4 12 000 rpm离心15 min。（4）加入0.2 mL氯仿，盖紧离心管盖，剧烈摇动30 sec，室温放置5 min，再4 12 000 rpm离心10 min。（5）上清液转入新离心管，重复步骤（4）。（6）上清液转入新离心管，加入两倍体积的预冷异丙醇，轻轻混匀，-20放置1h，再4 12 00
9、0 rpm离心10 min。（7）倒掉上清液，加入1 mL的预冷的75% 酒精漂洗，再4 7500 rpm离心5 min。离心完成后，倒掉废弃的酒精。漂洗步骤可重复1次。（8）漂洗后的沉淀经风干后，加入50 L DEPC处理过的水溶解，-20保存备用。（9）RNA浓度和质量检测：用紫外分光光度计测定浓度。取0.1 g RNA样品进行电泳（琼脂糖凝胶浓度0.8%，电压90 V，电泳时间30 min），根据凝胶成像结果观察RNA质量。附件3:DNA提取操作步骤（1）取样品放入液氮遇冷的研钵，加入液氮后使用研磨棒将样品研磨至粉末状，再将0.5 g粉末转入到10 mL的离心管中。（2）加入64 预热的
10、CTAB提取液5 mL，充分混匀，置于64 水浴中保温1 h，每隔10 min轻缓颠倒混匀一次，再4 12000 rpm离心15min。（3）上清液转入新离心管，加入等体积Tris-平衡酚-氯仿-异戊醇（25：24：1），轻缓颠倒混匀，室温静置5min，再4 10000 rpm离心10 min。（4）上清液转入新离心管，加入等体积氯仿-异戊醇（24：1），充分混匀，室温静置5min，再4 10000 rpm离心10min。（5）上清液转入新离心管，加入2倍体积预冷异丙醇，混匀，-20静置1h以上，再4 10000 rpm离心10 min。（6）倒掉上清液，加入1 mL的75% 酒精漂洗， 再4
11、 7500 rpm离心5 min。漂洗步骤可重复2-3次。（7）漂洗后的沉淀经风干后，加入100 L 灭菌去离子水溶解。（8）加入1l RNase A（20 mg/ml），充分混匀，37 水浴1 h，去除残留的RNA。 （9）DNA浓度和质量检测：用紫外分光光度计测定浓度。取0.5 g DNA样品进行电泳（琼脂糖凝胶浓度0.8%，电压100 V，电泳时间30 min），根据凝胶成像结果观察DNA质量。HNZ087-2015附件4柑橘（类似）病毒分子生物学检测的技术参数病害上游引物下游引物目的片段退火温度衰退病GGACAAACTTTIITTTCTGTGAACCTTTCGATGAAGTGGTGTT
12、CACGGAGAACTC612 bp55碎叶病CCCTCTCAGCTAGAATTGAACAGGCATGTCAACCTGCAAG800 bp56裂皮病GGAGGAAGTCGAGGTCAGGTTTCCCCGGGGATCCCT370 bp55黄龙病GCGCGTATGCAATACGAGCGGCAGCCTCGCGACTTCGCAACCCAT1160 bp55温州蜜柑萎缩病GGGAGATGATAGGAGCAAGAGAGATTTCTACTCGCA251 bp58_湖南省农业技术规程HNZ088-2015棉花黄萎病抗性评价技术规程Technical regulations for evaluating res
13、istance of cotton to verticillium wilt 湖南省农业委员会制定发布日期：2015年10月29日HNZ088-2015棉花黄萎病抗性评价技术规程为规范棉花抗黄萎病资源的筛选和品种选育，制订本规程。1棉花黄萎病症状及病原菌特性1.1症状 在温室和人工病圃中，24片真叶期的棉苗即开始发病。苗期的症状是病叶边缘开始褪绿发软，呈失水状，叶脉间出现不规则淡黄色病斑，病斑逐渐扩大，变褐干枯，维管束明显变色。在自然条件下，棉花现蕾以后才逐渐发病，一般在7、8月开花结铃期发病达到高峰。近年来，其症状呈多样化的趋势，常见的有：病株由下部叶片开始发病，逐渐向上发展，病叶边缘稍向上
14、卷曲，叶脉间产生淡黄色不规则的斑块，叶脉附近仍保持绿色，呈掌状花斑，类似花西瓜皮状；有时，叶片叶脉间出现紫红色失水萎蔫不规则的斑块，斑块逐渐扩大，变成褐色枯斑，甚至整个叶片枯焦，脱落成光秆；有时，在病株的茎部或落叶的叶腋里，可发出赘芽和枝叶。黄萎病株一般并不矮缩，还能结少量棉桃，但早期发病的重病株有时也变得较矮小。夏季暴雨后，有些病株常发生一种急性型黄萎症状，先是棉叶呈水烫样，继则突然萎垂，迅速脱落成光秆（见附件1）。1.2病原菌特性在我国，棉花黄萎病菌主要为大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb），该菌属于真菌界（Fungi），半知菌亚门(Deuteromycotina)，丝孢纲（Hyphomycetes）,丝孢目（Hyphomycetales）,淡色孢科(Moniliaceae)，轮枝菌属(Verticillium)。棉花黄萎病菌分生孢子，呈椭圆形，单细胞，大小为4.011.01.74.2m，由分生孢子梗上的瓶梗末端逐个割裂。空气干燥时，孢子在瓶梗末端聚集成堆，空气湿润时，则形成孢子球。显微镜下制片观察时，孢子即散开，只留下梗端新生出的单个孢子。病菌分生孢子梗常由24轮生瓶梗及上部
