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1、湿热灭菌工艺的微生物学验证知识 1 概念与方式 n基础概念 n灭菌工艺 n无菌 n药品达到无菌要求的两种方式 n无菌生产工艺 n最终灭菌 2 两种生产方式的比较 n无菌生产工艺的局限 n通常的无菌保证水平（10-3至10-6） n影响因素较多 n最终灭菌工艺的优点 n赋予产品更高的无菌保证水平 n生产中可变因素少，出现偏差的概率低 n几乎能杀灭产品中的所有微生物 3 制药工艺中常用的灭/除菌方式 n热力灭菌 n湿热灭菌 （118-134）-蒸汽、过热水 n干热灭菌（160-320 ）-热空气 n气体灭-环氧乙烷 n离子辐射灭菌-辐射和电子束辐射 n过滤除菌法-过滤名义孔径小于等于0.2m 4
2、热力灭菌的基本原理 n湿热灭菌导致细胞内关键性蛋白质 和酶发生热变性或凝固.湿度对该破坏 性过程起促进作用. n干热灭菌-使微生物氧化而不是蛋白 质变性. 5 细菌细胞结构 n细胞质膜 n细胞壁 n荚膜 n异染颗粒 n线毛 n鞭毛 n色素体 n脂质颗粒 n中体 n核糖体 n拟核 n模隔壁 6 湿热灭菌的热力学基础 水-蒸汽系统处在饱和状态时的性质 温度压力Bar焓（内部热量）J/g 水hLh*蒸汽hV 1001.01341922562675 1151.69248322162699 1201.98750422022706 1212.02650821992707 1252.322525218827
3、13 饱和蒸汽表 h = hV-hL，凝结或汽化潜热，1 Atmosphere = 1.013 bar = 14.71 psia 7 热力灭菌设备 n过热水灭菌釜 n干热灭菌釜 n蒸汽灭菌釜 8 湿热灭菌工艺研发与确认 灭菌工艺的验证 工艺研发阶段工艺确认阶段 方法设计装载类 型工艺类 型工艺开发性能确认连续 控制 非产品特异 性灭菌工艺 (过度杀灭 法) 产品特异性 灭菌工艺 蒸汽不可透 过型物品 (液体型) 蒸汽可透过 型物品 饱和蒸汽型 预真空式 重力式 空气超压型 蒸汽/空气 混和方式 过热水方 式 确定参数 升温阶段 保温阶段 降温阶段 物理学方法 温度分布 热穿透 生物学方法 日常
4、放行 工艺评估 系统适用 性 再确认 变更控制 9 最终灭菌产品无菌的标准 .无菌检查结果合格-存在局限性 批检不合格率、实际污染率和取样量之间的相互关系 取样量 实际污 染率 0.1151015 100.010.090.400.660.80 200.020.180.650.890.96 50 0.050.340.920.99 1000.090.630.99 3000.260.95 30000.95 10 最终灭菌产品无菌的标准 n通过物理/生物学方法证明，单位产 品内微生物存在的概率不超过百万 分之一(即批产品的污染概率不超过 百万分之一). 可实现参数放行 11 影响灭菌效果的因素 n物理
5、化学条件 环境因子 芽孢是否处于被包裹状态 n湿度 n微生物的热致死特性 12 适于湿热灭菌工艺验证的微生物 菌种名称D121 值范围(min) 嗜热脂肪芽孢杆菌 Geobacillus stearothermophilus 1.5-3.0 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 0.3-0.7 凝结芽孢杆菌 Bacillus coagulans 0.4-0.8 梭状芽孢杆菌 Clostridum sporogenes 0.4-1.0 13 实现无菌要求的标准手段 n热稳定性产品(过度杀灭) 美国 产品灭菌工艺的F0值不低于12分钟; 欧盟 12115分钟 n热敏感性产品 控制产品在
6、灭菌前的带菌量 产品灭菌工艺的F0值不低于8分钟. 14 药典要求 nEP 对过度杀灭法的工艺要求： 对溶液的灭菌条件至少为121oC 15 分钟 ；也可采用其它组合条件，但灭菌效果须与 上述相等效。 目标：无菌保证值（SAL，污染概率的负对数 ）大于等于12。 15 药典要求 nUSP 对过度杀灭法的工艺要求： 对溶液的灭菌条件需达到12D ，至少为12 分 钟。 n设计目的： 使D121=1分钟，数量为106的微生物经过灭 菌后达到SAL= 10-6。 16 灭菌程序的开发与设计 n根据灭菌前带菌量进行设计 基于对灭菌前产品所含微生物的耐热特性和数量以及产品的 热稳定性 灭菌后产品的污染概
7、率须小于10-6。 n过度杀灭法 基于工艺程序能杀灭更加耐热微生物，并且再加上 一定的安全系数； 理论上对生物指示剂孢子的杀灭能力达到10-12。 n将两者相结合 兼顾产品的热稳定性和无菌要求。 17 灭菌程序的效力测定 n生物学手段（FBiological） 用特定的生物指示剂作为标准微生物制剂 数据直接反映灭菌效果 有时可取代物理手段的不足(如探头无法放入安瓿瓶) 局限性：较难进行统计学分析 n物理/数学手段（FPhysical） 用灭菌值F0作为评价标准 精确测定热分布和热穿透状况 便于准确计算不同灭菌条件下的灭菌效果 测量数据便于统计学分析 18 灭菌工艺验证 n确认（IQ、OQ） 灭
8、菌设备的运行符合设计要求 n验证（PQ） 产品灭菌程序的有效性和重现性 n评估 灭菌时产品可能发生的变化给灭菌效果带来 的影响 19 灭菌工艺验证-IQ/OQ n检查设备构造、控制/监测系统、运行系统、安全系统及所 有零部件均与采购要求相同； n控制/监测仪表的校验，包括程序控制器、温度、压力和时 间控制设备，以及计时器、记录测量仪等； n试车空载热分布试验 温度探头10-20支；探头精确度0.5 oC; 须有探头与腔室原探头并列放置; 检测报警和安全系统的可靠性; 真空系统的可靠性(产生的效率、维持时间等); 灭菌温度下，各点间最大温差（腔室内的） = 2 oC；同一点的最大温 差1.0 o
9、C; 重复试验至少3次以证明重现性 20 灭菌工艺验证PQ (一) n每种装载方式下的热穿透试验 证明特定灭菌程序杀灭微生物的均一性和有效性; 重复性试验证明灭菌程序的重现性和稳定性; 证明灭菌程序对被灭菌物品的相容性. n容器内部产品的热穿透试验 证明在每种装载方式下各点的均一性、程序的重现 性 证明最冷点处所获得的灭菌效果符合既定要求。 21 灭菌工艺验证PQ (二) n生物指示剂试验 结果与热穿透试验保持一致 所有测试点均应确保SAL 不低于6 试验次数足以符合统计学要求（至少重复3 次试验，指示剂数量10 20 支/次）。 22 再验证和变更管理 n再验证 进行再验证的条件 设备、产品
10、、工艺有重大改变，或设备有重大维修 定期的常规再验证（一次/12-24 月） 验证方法 通常与初次PQ 方案相同。 n变更管理 有相关SOP 来评价变更对工艺的潜在影响 根据变更评估结果确定再验证的范围23 无菌的影响因素 nNt = N0 -NR PNSU = N0 -DR Nt 灭菌后微生物残存量； PNSU -非无菌品概率； N0 -灭菌前微生物含量； N0 -灭菌前产品的污染 水平； NR -灭菌时的杀灭量。 DR -灭菌时的杀灭水平 。 24 热力灭菌的基本规律 n在一定温度下微生物数量的对数 值与灭菌时间的线性关系 微生物数量的对数值随灭菌时间的增加而减少 25 耐热参数D 值的定
11、义 nD 值指一定温度下，将微生物杀灭90（即 下降一个对数单位）所需要的时间（Time for decimal reduction） 26 D T值的影响因素 n挑战微生物的种类 n挑战微生物的贮存条件 n挑战微生物的恢复生长和培养条件 n灭菌釜的灭菌工艺温度 nDT值测定开始前的起始温度 n悬浮液和恢复生长用培养基种类 n灭菌结束后的放置温度与时间 n蒸汽的饱和度 n原始包装材料 27 耐热参数Z 值的定义 nZ 值是指当某种微生物的D值下降（或上升） 一个对数（log ）单位时，其温度应升高（ 或降低）的度数。 28 灭菌率的概念 n灭菌率(L值)系指在某温度下灭菌1分钟所 相应的标准灭
12、菌时间(分钟)，即F0和FT的 比值(LF0/FT)。当Z10时，不同温度下 的L值是不同的。 29 商购生物指示剂的确认 n1. 进行形态学和纯度确认(至少鉴别至菌属) n2. 芽孢计数复核 -蒸汽灭菌工艺用BI，95-100下暴热预处理15 分 钟 -环氧乙烷和干热灭菌工艺用BI，80-85下暴热预 处理10 分钟 -预处理后迅速转移至冰水浴内 -合格标准：Log( 实测值)在0.3-1.48Log( 标示值) 之间 3. D值复核(视实验室能力而定) 30 F0的定义及其意义 nF0是指在某特定温度下所产生的灭菌效果与在121.1oC 下相等效时所需要的灭菌时间（分钟）. n121.1
13、oC 或250 oF表示100 KPa 饱和蒸汽的温度, 为 标准灭菌温度； nF 0值用于评价热（湿/干热）灭菌工艺的对微生物的杀灭 效果. nF0值可用来比较不同温度下的灭菌效果 nF0值既可用生物学方法测定，也可用数学方法积分测得（ 积分时务必采用121.1 oC, 因为每相差0.1 oC, F0 将会 产生2.4% 的偏差） 31 药典对F0 的要求 nBP 蒸汽灭菌程序赋予产品的F0值不得低于8分钟 制定依据: 多数嗜温性细菌芽孢在121.1 oC下的D值在30秒 至1分钟之间. nUSP 蒸汽灭菌过度杀灭程序赋予产品的F0值不得低于12 分钟. 目标: 使在121.1 oC下D值为1分钟的细菌芽孢下降12个对 数单位(双倍于无菌保证值). 可采用其它灭菌程序，但要保证符合无菌标准 nEP 、CP 蒸汽灭菌程序通常应为在121 oC下灭菌15分钟 可采用其它灭菌程序，但要保证符合无菌标准 32 F0与FT的相互关系 nF0 = D121.1 ( logN0 -logNt ) nFT = DT ( logN0 -logNt ) F0 / FT = D121.1 / DT = 10(T 121.1)/Z = L (灭菌率) 33
