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1、复旦大学2011届望道学者结题报告与心得集人病原体难辨梭状杆菌中钴铁硫蛋白的克隆、表达、纯化、以及甲基转移活性研究化学系 张思学指导教师 谭相石 摘要：本实验探索了一套有效的克隆、表达、纯化和体外重组具有生物活性的难辨梭状杆菌（Clostridium Difficile）中钴铁硫蛋白的方案。钴铁硫蛋白的两个亚基CfsAcd和CfsBcd分别构建入MBPHT-mCherry2和pETDuet-1载体，在大肠杆菌菌株BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中表达。其中CfsAcd采用了MBP标签可溶性表达，CfsBcd采用了包涵体提取的方法。利用Ni-TNA柱纯化后的两个亚基再体外组装钴胺素
2、和铁硫簇Fe4S4。经过对重组的钴铁硫蛋白进行的ICP-AES金属含量分析、紫外可见光谱表征、和stopped flow快速反应动力学测定，证明了所重组得的蛋白结构正确，具有甲基转移的生物活性。关键词：难辨梭状芽孢杆菌；Wood-Ljungdahl代谢通路；钴铁硫蛋白；Fe4S4立方簇；钴胺素；大肠杆菌异源表达；甲基转移活性AbstractThe corrinoid iron-sulfur protein consists of two subunits, a cobalamin cofactor, and a Fe4S4 cluster. The genes encoding subunit
3、 and were recombined with vector MBPHT-mCherry2 and pETDuet-1 respectively . They are expressed in E. coli. strain BL21-CodonPlus(DE3)-RIL. Subunit was obtained by soluble expression with an maltose-binding protein(MBP) fusion tag. Subunit was extracted from inclusion bodies. Proteins were purified
4、by Ni-TNA column and gel filtration column. After reconstitution of Fe4S4 and cobalamin, the corrinoid iron-sulfur protein can be obtained. The characterizations include ICP-AES, UV-vis, and stopped flow kinetics. It can be proved that the reconstituted corrinoid iron-sulfur protein has correct stru
5、cture and methyltransfer activity. KeywordsClostridium Difficile; Wood-Ljungdahl pathway; Corrinoid iron-sulfur protein; Fe4S4 cluster; Cobalamin; E. coli expression system; Methyltransfer activity前言难辨梭状杆菌(Clostridium difficile)是公认的医院内感染和抗生素相关性腹泻最重要的病因。进入21世纪以来, 艰难梭菌感染(Clostridium difficile infectio
6、n, CDI)的发病率和疾病的严重程度在全球范围内呈上升趋势。 2001年后, 在北美、澳大利亚及欧洲等国家, 出现了C.difficile 的高毒力菌株BI/NAP1/027/毒素型。C.difficile 相关性腹泻(Clostridium difficile -associated diarrhea, CDAD)的地区播散性暴发流行1,2, 常导致住院患者的病死率大幅升高。 CDI已成为一个严重的公共卫生问题3-5. 难辨梭状杆菌又称艰难梭菌, 是一种革兰阳性厌氧芽孢杆菌, 可存活于水、土壤等自然环境、动物体内及医院环境中, 其芽孢在医院环境及医务人员手上可存活6个月3。1935年, H
7、all和OToole首次从健康的新生儿粪便中分离出该菌,目前发现1%-3%的健康成人、40%-60%的新生儿、16%-35%的住院患者粪便中携带此菌6。C.difficile 通常产生两种主要毒素: 毒素A是一种肠毒素, 对白细胞有趋化作用, 主要引起肠道炎症、液体分泌和黏膜损伤, 也有一定的细胞毒性作用。毒素B是一种细胞毒素, 可刺激单核细胞释放炎性细胞因子, 对哺乳动物细胞产生细胞毒性作用。毒素B的毒力较毒素A强10倍7. C.difficile 是一种条件致病菌, 在正常人体内的细菌群中所占比例很少, 肠道的正常菌群能拮抗和制约C.difficile在肠道定居, 故一般不会致病。1978
8、年, Bartlett等8首次报道了C.difficile释放细胞毒素是滥用抗生素引起伪膜性肠炎的病因, 这是由于抗生素的应用破坏了人体肠道的正常微生态平衡, 使C.difficile得以迅速繁殖并产生毒素而致病。由于CDI的严重危害性，有必要对艰难梭菌的代谢通路及潜在的药物靶点蛋白进行研究，以便设计出一些有效的抗生素类药物。本文所研究的钴铁硫蛋白(corrinoid iron sulfur protein，简称为CoFeSP )位于病原体难辨梭状杆菌Wood-Ljungdahl通路中。Wood-Ljungdahl代谢通路广泛存在于厌氧细菌和古细菌中，是厌氧微生物三条枢纽性碳代谢途径之一（逆三
9、羧酸循环，3-羟基丙酸循环，Wood-Ljungdahl 通路9）。该通路可利用环境中的CO2合成重要的代谢中间体乙酰辅酶A10,11（过程见图1）。首先，二氧化碳在氢质子的参与下由甲酸脱氢酶(Formate dehydrogenase，简称为FDH) 催化还原为甲酸。随后，甲酸在另外四种酶的逐一催化下转变得到甲基四氢叶酸，甲基四氢叶酸在甲基转移酶 (methyltransferas，简称为MeTr) 的催化下将其甲基转移给钴铁硫蛋白，形成甲基钴铁硫蛋白，该蛋白再将其甲基转移给乙酰辅酶 A 合成酶(acetyl-CoA synthase，简称为ACS)形成甲基乙酰辅酶 A 。同时CO 脱氢酶
10、(Carbon monoxide dehydrogenase，简称为CODH)还原一分子的CO2产生 CO。在乙酰辅酶 A 合成酶的催化下由 CH3-ACS 的甲基与 CO 和辅酶 A合成乙酰辅酶 A，从而完成整个合成通路12。图1 Wood-Ljungdahl 代谢通路示意图钴铁硫蛋白是 Wood-Ljungdahl 通路中承上启下的甲基转移转化器, 它首先在甲基转移酶催化下接受甲基四氢叶酸的甲基(反应式1), 然后将甲基再转移给乙酰辅酶A 合成酶(反应式2):目前, 已经被分离和表征的 CoFeSP 有三种,它们分别来源于三种不同的厌氧细菌：产乙酸菌Moorella thermoaceti
11、ca13, 产甲烷菌 Methanosarcina thermohila14 及产氢菌 Carboxydothermus hydrogenoformans15。 这些钴铁硫蛋白 CoFeSP 均为异源二聚体蛋白, 基因序列分析表明它们之间的基因同源性为35%53%。2006 年, Dobbek 等16在美国科学院院报(PNAS)上首次报道了来源于产氢菌 Carboxydothermus hydrogenoformans的 CoFeSP的晶体结构, 这是到目前为止唯一一个 CoFeSP 的晶体结构报道(见图2a)。 据目前已知的信息，CoFeSP是一个异源二聚体蛋白,包括一个大亚基(简称CfsA
12、)和一个小亚基(简称CfsB)。两个亚基紧密的结合在一起, 呈假双重对称(pseudo- twofoldsymmetry)。金属中心包括一个类咕啉辅因子和Fe4S4 铁硫簇。其中类咕啉辅因子是一个具有维生素B12结构的咕啉环(见图2b)17, 中心钴原子除了与环上四个 N 原子配位以外, 还有两个开放的配位位点。铁硫簇呈立方结构，四个硫原子来源于CfsA上的四个半胱氨酸残基。CfsA包含三个结构域, Fe4S4 铁硫簇结合在 N 端结构域上, 中间结构域呈 ()8 筒状构象, 它和C-端结构域通过一个富含脯氨酸的连接片段(产氢菌中为18个氨基酸残基)来连接(图2c), 该连接片段在催化过程中起
13、了非常重要的作用。CfsB只有一个结构域, 呈 ()8 筒状构象。图2 钴铁硫蛋白的结构a:产氢菌中CoFeSP的晶体结构（PDB ID 2H9A）：大亚基分子量为48.4 kDa (红色部分)，小亚基为33.9 kDa(绿色部分)。b: 钴胺素的分子结构 c: 产氢菌中CoFeSP大亚基晶体结构: 大亚基分为N端结构域(氨基酸残基158，绿色部分)、中间结构域(氨基酸残基59316，红色部分)、和C-端结构域(氨基酸残基334441，青色部分)。CfsB中的铁硫簇与CfsA的第一个氨基酸Pro59相距17. 以最近的铁钴之间的距离计算, 铁硫簇与类咕啉辅因子相距约有52之多。Dobbek 教
14、授等提出了一个描述整个催化过程的模型。他们认为CfsA亚基C端结构域在催化过程中可以移动, 移动通过柔性的连接片段(氨基酸残基317333)来控制。该结构域的移动使得CoFeSP、ACS的活性位点和承载MeTr的甲基四氢叶酸能够进行必要的相互作用, 从而实现乙酰辅酶A 的合成, 而且C端结构域的构象变化可以有效的保护钴的两个开放配位位点（见图3）16.图3 钴铁硫蛋白的甲基转移催化机理模型橙色部分为乙酰辅酶A合成酶（ACS），蓝色部分为CfsBcd，红色部分为CfsAcd，绿色部分为甲基转移酶（MeTr）。虽然对产氢菌中的钴铁硫蛋白已经有了基因克隆和蛋白表达纯化的报道，也有了一定的结构和活性研
15、究。但目前却没有任何关于病原体C.difficle 中的CoFeSP的基因克隆及蛋白表达与纯化的文献报道。基因组测序成功后，根据生物信息学，人们发现该基因组中两个编号为cd0725和cd0726基因片段分别含314和455个氨基酸残基，并将其命名为CoFeSP的亚基和亚基。为了以示区别，将C.difficile中的亚基简称为CfsAcd，亚基简称为CfsBcd。由于产氢菌中该蛋白的晶体结构已有报道，并且也有相关的生物活性实验数据，这就为本病原体中该蛋白的研究提供了参考的依据以及可供比较的数据。目前仅有的两篇关于嗜热菌中CoFeSP 的大肠杆菌重组表达的报道，均是在得到前体蛋白以后进行化学重组从
16、而得到全蛋白18,19。主要有两个原因，首先该类蛋白的铁硫簇处在蛋白的表面，由于铁硫簇厌氧的特性，因此极易被破坏，需要通过化学重组来重新组装；其次，大肠杆菌重组表达含钴啉和类钴啉的金属蛋白，要想通过生物组装来实现，条件要求很苛刻。所以化学重组仍然是一种比较通用的方法。1实验部分1.1实验材料和仪器病原体C.difficile 630 基因组DNA购自美国ATCC （编号9689D-5）。MBPHT-mCherry2 载体为复旦大学生命科学学院丁滪博士馈赠。pETDuet-1、TEV 酶表达质粒pRK1043、大肠杆菌菌株XL10-Gold和BL21-CodonPlus(DE3)-RIL 购自Novagen 公司。Pfu DNA聚合酶、T4 DNA 连接酶，dNTP 以及限制性内切
