中药材DNA条形码分子鉴定指导原则

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1、中药材中药材DNA条形码分子鉴定条形码分子鉴定指导原则指导原则 1. 背景背景 中药材存在多基原物种及同名异物、同物异名等问题，鉴于传统基原鉴定、 性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定方法存在局限性，为保证中药材临床应用安全、 准确、有效，有必要增加中药材DNA条形码分子鉴定法。 2. 定义及原理定义及原理 DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列 来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，是传统形态鉴别方法的有效补充。由于 DNA序列是由腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)四种碱基以不同 顺序排列组成，因此一定长度DNA序列能够区分不同物种。 中药材DNA条

2、形码分子鉴定是以ITS2为主体条形码序列鉴定中药材的方法 体系，其中植物类中药材选用ITS2为主体序列，psbA-trnH为辅助序列，动物类 中药材采用COI为主体序列，ITS2为辅助序列，符合中药材鉴定简单、精确的特 点，有明确的判断标准，能够实现对中药材及其基原物种的准确鉴定。本指导原 则用于规范中药材DNA条形码分子鉴定法，为其应用提供指导。 3. 适用范围适用范围 适用于中药材(包括药材、药材粉末及部分药材饮片)及基原物种的鉴定。 4. 方法流程方法流程 中药材DNA条形码分子鉴定法主要包括供试品处理、DNA提取、PCR扩增、 测序、 序列拼接及结果判定， 以下内容详细说明各流程中的主

3、要原理及注意事项。 1）供试品处理供试品处理 除特殊标明外，药材使用75%乙醇擦洗表面后晾干，称取10-100 mg备用。 具体见各药材项下。 2）DNA提取提取 DNA的提取包括破碎细胞壁、释放DNA，DNA的分离和纯化，DNA的浓缩、 沉淀与洗涤等基本步骤，目前常用试剂盒法，包括植物基因组DNA提取试剂盒 和动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒。 由于植物类中药材种类繁多， 可根据所研究中药材的具体情况对提取方法加 以改进。植物细胞内储存了大量次生代谢产物，如多糖、多酚等，这些物质在提 取DNA的过程中与DNA共沉淀，形成粘稠的胶状物难以溶解或产生褐变，严重 影响DNA提取的产量与质量，

4、以及后续的PCR扩增实验。 -巯基乙醇是抗氧化剂， 在提取DNA过程中加入-巯基乙醇，可以抑制氧化反应，避免褐化。PVP(聚乙 烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚， 减少DNA提取过程中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。因此 将PVP和-巯基乙醇配合使用， 能够有效地防止DNA提取过程中多酚及多糖的污 染。EDTA(乙二胺四乙酸)螯合Mg2+或Mn2+，抑制DNase(DNA酶)活性；CTAB(十 六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与DNA形成复合 物。 在天然状态下， DNA与蛋白质以DNP(DNA蛋白质复合物)的形式存在

5、， CTAB 可使细胞中的DNA蛋白质复合物释放出来，该复合物在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)能充分溶解，存在于液相中。通过有机溶剂抽提，去除蛋白质、多糖、酚 类等杂质后加入乙醇沉淀即可使DNA分离出来。三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl) (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止DNA被破坏。 根、根茎、茎木类、皮类根、根茎、茎木类、皮类 通常根和根茎组织中多酚、多糖含量高，在研磨 时多酚极易氧化成醌类，在纯化过程中很难去除，使DNA带有一定颜色，影响 后续的PCR反应， 所以在提取根及根茎类药材DNA时一定要注意多糖、 多酚的去 除。提取根及根茎类药材DNA时水浴时间一般为90分钟，

6、对于质地坚硬的根、 根茎类和茎木类药材，可以采用延长水浴时间，如56水浴过夜，使得DNA充 分释放到缓冲溶液中。此外，根茎类药材由于富含纤维和贮藏物质，需较多样品 量才能提取到足量DNA，可用大体积离心管(5 mL或15 mL)抽提。皮类中药材组 织中富含薄壁组织和纤维等，加液氮不易研磨成细粉，需适当增加样品量，同时 应增加-巯基乙醇和PVP的使用量。 叶、花、全草类叶、花、全草类 该类药材采用试剂盒一般都能成功提取其DNA，对于保存 时间较久的叶、花、全草类药材可适当增加水浴时间，同时适当降低水浴温度， 如56水浴过夜等。 果实、种子类果实、种子类 果实及种子类中药材中多富含油脂，研磨时易被

7、氧化，且易 粘着在研钵壁上，损失较大，提取时需增加样品量。另外，对研磨后的材料可用 丙酮浸提，去除脂溶性酚类化合物。 动物药材动物药材 肌肉类动物药材如海龙、蛇类、蛤蚧等，需进行紫外杀菌处理， 并且需要充分磨碎。含有脂类较多的动物内脏器官如蛤蟆油，首先用不含蛋白酶 K和SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液浸泡药材，SDS是一种阴离子表面活性剂， 在5565条件下能裂解细胞，释放出核酸；然后在试剂盒消化缓冲液中增加 SDS含量，有利于脱去脂类。骨甲类药材如龟甲、鳖甲和鹿茸等，由于DNA含量 较低，样品量要适当增大，也可用大体积离心管(5 mL或15 mL)抽提。 3）PCR扩增扩增 植物类中药材及其

8、基原物种扩增ITS2或psbA-trnH序列，动物类中药材及其 基原物种扩增COI序列， 通用引物及扩增条件如下， 具体如有改变见各药材项下。 ITS2序列扩增正向引物ITS2F：5-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3；反向 引物ITS3R：5-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3。psbA-trnH序列扩增正向引 物psbAF： 5-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3； 反向引物trnHR： 5-CGCGCA- TGGTGGATTCACAATCC-3。COI序列扩增正向引物HCO2198：5-TAAACTT- TCAGGGTGACCAAAAAATCA-3；

9、反向引物LCO1490： 5-GGTCAACAAATCA- TAAAGATATTGG-3。 PCR反应体系以25 L为参照， 包括： 1 PCR缓冲液(不含MgCl2)， 2.0 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs，0.1 mol/L引物对，模板DNA，1.0 U Taq DNA聚合 酶，加灭菌双蒸水至25 L。设置未加模板DNA的PCR反应为阴性对照。 ITS2序列扩增程序：94 5 min；94 30 s，56 30 s，72 45 s，40个 循环；72 10 min。psbA-trnH序列扩增程序：94 5 min；94 1 min，55 1 min，72 1.

10、5 min，30个循环；72 7 min。COI序列扩增程序：94 1 min； 94 1 min，45 1.5 min，72 1.5 min，5个循环；94 1 min，50 1.5 min， 72 1 min，35个循环；72 5 min。 4）PCR产物检测产物检测 采取琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR产物。电泳后，PCR产物应在相应的DNA 条形码序列长度位置(具体见各药材项下)出现一条目的条带，阴性对照应无条 带。 5）测序）测序 使用DNA测序仪对目的条带进行双向测序， PCR扩增引物作为测序引物， 测 序原理同Sanger测序法。有PCR扩增条带的样品送测序公司进行DNA序列测定。

11、6）中药材）中药材DNA条形码序列获得条形码序列获得 （1）序列拼接 对双向测序峰图应用专业软件进行序列拼接， 去除引物区， 获得相应的DNA 序列。 （2）序列质量与方向 为确保DNA条形码序列的可靠性，需对测序质量进行评估，去除测序结果 两端的低质量序列。序列方向应与PCR扩增正向引物方向一致。 7）结果判定）结果判定 将获得的序列在中药材DNA条形码鉴定系统( )或 GenBank数据库中应用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)方法进行结果 判定， 结果中相似性最高的序列对应物种为查询序列最接近的物种。如果植物类 药材ITS2序列比对后最接近的

12、物种为真菌，则需采用psbA-trnH序列重复上述方 法流程。 （1）中药材DNA条形码鉴定数据库系统鉴定操作流程 登录中药材DNA条形码鉴定数据库系统网站， 在主页点击“物种鉴定”。 根据 需鉴定物种的种类，选择对应的鉴定数据库，如点击植物类药材鉴定(ITS/ITS2)。 将需要鉴定的物种序列复制后粘贴到“植物类药材鉴定(ITS/ITS2)”的序列输入 栏，点击“提交”按钮，进行BLAST鉴定。在BLAST比对结果中，在“序列比对信 息”栏查看相关比对信息， 在“物种鉴定结果”栏显示与所查询序列最接近的物种。 （2）GenBank数据库BLAST鉴定系统操作流程 登录GenBank数据库BL

13、AST鉴定系统(http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)， 在Basic BLAST中选择nucleotide blast， 在Enter Query Sequence中粘贴需要鉴定的 序列(Query)(建议用fasta格式)。在Choose Search Set中选others(nr etc.)数据库，点 击左下角BLAST。 在BLAST结果中查看序列相似性最高(Max ident)的物种， 一般 为与查询序列最接近的物种。 5. 中药材中药材DNA条形码数据库构建原则条形码数据库构建原则 建立中药材DNA条形码数据库时，应在药材原产地及主产地采集供

14、试品， 采用经典分类方法确定其基原，采集样本尽可能覆盖其分布区，每个物种采集来 自不同产地样本20份以上。根据具体药材测定ITS2或psbA-trnH或COI等DNA条 形码序列，分析确定该药材DNA条形码序列种内变异大小。对实验获得或 GenBank中的中药材DNA条形码序列必须经过核准后方可录入中药材DNA条形 码数据库，同时需定期对数据库进行更新。 6. 方法学验证方法学验证 1）影响因素考察 考察DNA条形码分子鉴定法的影响因素，包括DNA提取(样品量、水浴温度 和水浴时间)、PCR条件(变性时间、退火温度与时间及延伸时间)及产物纯化(考 察不同纯化试剂盒)，保证实验方法的准确性。 2

15、）精密度考察 （1）重复性 至少用3批供试品，每批3次或同批供试品进行6次测定试验后对结果进行评 价。实验结果判定应基本一致。 （2）中间精密度 考察实验室内部条件改变(如不同人员、不同仪器、不同工作日和实验时间) 对测定结果的影响，至少应对同实验室不同操作人员的结果进行考察。 （3）重现性 实验结果在3家以上实验室能够重现，相同样品在不同实验室获得DNA条形 码序列应相同。 3）方法适用性考察 采用DNA条形码分子鉴定法对20批次以上药材或基原物种进行测定，积累 数据，确定种内序列变异大小，保证该测定方法的适用性。 4）基原物种对比验证 以分类学家确认的基原物种叶片为对象，采用该方法获得DN

16、A条形码数据， 与相应药材产生的DNA条形码数据进行对比，避免内生真菌等污染，保证结果 准确性。 7. 注意事项注意事项 1）实验场所应具备分子生物学实验室的基本条件。 2）中药材DNA条形码分子鉴定法暂不适用于混合物及炮制品的鉴定。 3）为防止外源真菌污染，实验前须将实验用具进行高压灭菌，并用75%乙醇擦 洗药材表面。 有些药材本身含有内生真菌， 如果内生真菌存在于药材的外围组织， 则选用内部组织进行实验。 如果真菌遍布整个药材， 植物类药材需选用psbA-trnH 条形码(真菌内不含有该基因片段)，不能选用ITS2序列。为进一步确保实验结果 不被真菌污染， 研究者可在GenBank数据库应用BLAST方法对所获ITS2序列进行 检验，以确保序列鉴定准确。 4）中药材DNA条形码分子鉴定法不用于确定药用部位。DNA条形码分子鉴定是 利用通用DNA序列来进行物种鉴定，因此该方法可鉴定药材的基原物种，而不 能确定药用部位。 5）种内阈值的确定。同一物种的不同样品间存在一定的变异范围，即种